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柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建 总被引：8，自引：0，他引：8
以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株孢子化卵囊为驱动组，马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆，经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%，差异基因片段大小分布在250 bp～1.0 kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验，分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现，有4个cDNA片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。 相似文献
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应用抑制消减杂交技术,以花生种仁cDNA作为消减杂交的试验方(tester),以花生果皮cDNA作为驱动方(driver)进行消减杂交。经过两轮抑制PCR后,将第2次PCR产物与pGEM-TEasy载体相连,电击转化大肠杆菌,成功构建种仁特异表达cDNA文库。所长出菌落中91.2%为白色克隆,采用PCR法对阳性克隆进行鉴定,发现其中单一扩增条带的克隆约占86.5%,片段大小集中分布于200～800 bp之间。用花生种仁cDNA探针和果皮cDNA探针分别对文库高密度杂交点阵膜进行反向Northern杂交检测。根据杂交结果,初步从文库中挑取出254个差异点。花生种仁特异表达基因的初步筛选,为了解花生产量、品质形成相关的重要功能基因,也为将来应用植物基因工程手段改良花生产量和品质奠定基础。 相似文献
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[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库. 相似文献
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目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析 总被引：3，自引：1，他引：2
根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。 相似文献
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为克隆和研究淋球菌耐药相关基因，分别从耐药性淋球菌菌株RSM292C4和WHO标准参考淋球菌株WHO-A细胞中提取DNA，用RsaⅠ酶切成400-600bp的片段。将酶切耐药菌株基因DNA片段分别与不同的接头连接，再与标准参考菌株DNA进行消减杂交及抑制性PCR检测，将所得PCR产物与克隆载体连接，构建差异DNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，获得2500个克隆。随机挑取96个制备质粒进行PCR检测，均扩增出100-600bp大小的片段。耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆耐药淋球菌特异的未知新基因奠定了基础。 相似文献
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章卓 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(3):339-343
以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因. 相似文献
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绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。 相似文献
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为分离与鸡产蛋性能密切相关的重要基因或调控因子，利用抑制性消减杂交技术，以高产蛋鸡品种海兰褐商品代蛋鸡和产蛋量相对较低的地方鸡品种大骨鸡20周龄时的卵巢组织为试验材料，构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右，挑取720个克隆进行PCR筛选，获得657个阳性克隆，经过点杂交筛选后选择了536个阳性克隆，... 相似文献
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抑制性消减杂交(SSH)技术是近十年来才发展起来的一种克隆差异新基因的快速、高效的技术。本文通过与其他几种目前主要的差异基因分离技术的比较,介绍了SSH技术基本原理、基本过程及优缺点,并对SSH技术在植物基因研究应用上的最新进展进行评述。 相似文献
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Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics 总被引：1，自引：0，他引：1
To comprehensively identify integral membrane proteins of the nuclear envelope (NE), we prepared separately NEs and organelles known to cofractionate with them from liver. Proteins detected by multidimensional protein identification technology in the cofractionating organelles were subtracted from the NE data set. In addition to all 13 known NE integral proteins, 67 uncharacterized open reading frames with predicted membrane-spanning regions were identified. All of the eight proteins tested targeted to the NE, indicating that there are substantially more integral proteins of the NE than previously thought. Furthermore, 23 of these mapped within chromosome regions linked to a variety of dystrophies. 相似文献
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[目的]筛选出奶牛Y-X精子差异表达基因.[方法]利用固相磁珠扣除杂交技术分选高纯度奶牛Y精子对X精子的表达基因,获得的差异片段经SMART扩增后构建Y精子对X精子消减杂交cDNA质粒库,克隆测序,在线进行序列同源性分析.[结果]筛选出的4条候选基因均与牛EST数据库中的序列高度同源,其中之一确认为牛Sry基因,其余3条牛未知功能基因.[结论]基于磁珠上的固相扣除杂交技术有利于简单快速的富集差异表达基因,可用于筛选奶牛Y-X精子候选差异表达基因. 相似文献
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一种改进的固相扣除杂交法直接克隆全长差异表达基因 总被引：1，自引：0，他引：1
该文集多种分离差异表达基因方法的优点于一体,自行优化了一种基于固相扣除杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术直接克隆全长差异表达基因的策略．该策略中的所有操作步骤,包括poly (A)+mRNA的分离,cDNA的合成和扣除杂交都是在磁珠上进行的,操作简单易行．扣除杂交是用结合在磁珠上的以oligo(dT)为引物合成的对照材料（Driver）的cDNA第一链,直接扣除加有接头的处理材料（Tester）cDNA第二链中的共有序列．多次反复使用Driver一链与Tester二链进行杂交,能有效去除Tester二链中的共有序列.磁珠的分离能最小限度地减少每次杂交造成的损失．最后一轮扣除后的Tester二链中,含有大量差异表达序列,用Tester二链特有的接头引物进行扩增,能进一步提高扣除效率．该文选用此扣除方法,成功分离到了低温驯化沙冬青幼苗和对照苗2个群体的18个差异表达克隆,其中有4个克隆是全长cDNA序列．经序列分析发现,这些基因都与低温相关,进一步说明,该方法可用于克隆未知差异表达基因． 相似文献
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甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建 总被引：2，自引：0，他引：2
以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性. 相似文献
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应用抑制差减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门氏菌C79-13与肠炎沙门氏菌50041进行基因组片段的差异分析,构建鸡白痢沙门氏菌的差减文库。经Dot-blot筛选,并对部分片段进行测序和同源性分析。结果表明:这些序列主要分为3类,即型分泌系统相关序列、质粒转移相关序列、未知功能序列。其中2个差减片段与编码福氏志贺菌侵入质粒抗原IpaJ蛋白基因的同源性达50%。证明所构建的差减文库可为鸡白痢沙门氏菌特异性致病基因和其致病机理的研究提供重要的依据。 相似文献