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鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。 相似文献
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应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。 相似文献
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克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体. 相似文献
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以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中.经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并进行序列测定验证.结果表明,该基因由1 716个核苷酸组成,共编码571个氨基酸.与GenBank下载的11株参考毒株的HN基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、GY97等毒株的核苷酸同源性高达97%以上,而与Lasota、F48E9等经典NDV株的同源性在80%～83%之间.说明HZ株与经典NDV株的亲缘关系较远,而与江苏近年来分离的鹅源副粘病毒株的亲缘关系非常近;本试验克隆到的是完整的鹅副粘病毒HN基因. 相似文献
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番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建 总被引：1，自引：1，他引：0
根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。 相似文献
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为研制抗新城疫病毒的基因工程疫苗,将新城疫病毒F48E8株F和HN基因的核心片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组,最后将重组子转染TN5细胞,得到含F片段和含F HN片段的重组杆状病毒rBac F和rBac F HN。PCR扩增结果证实F和F HN基因片段重组到杆状病毒基因组中;SDS-PAGE和Western blot检验结果表明F和F HN基因片段在重组病毒中得到了表达。 相似文献
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为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V. 相似文献
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利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。 相似文献
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牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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新城疫是由新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病,严重危害全球养禽业.DNA疫苗因其独特的安全、有效等特点将会是解决传统疫苗不足的新途径.为了评价NDV保护性抗原F、HN融合基因的效果,以PBS作为空白对照,将pVAX Ⅰ、pVAX Ⅰ-F、pVAX Ⅰ-HN和pVAXⅠ-F-HN四种质粒肌肉注射2周龄雏鸡,一免后二免.IHA检测免疫期血清样本（1次/7d）抗体效价;二免后,FCM检测外周血淋巴细胞亚群,淋巴细胞增殖实验检测脾细胞淋巴细胞增殖情况;免疫完毕14d后用105 EID50的lasota株NDV滴鼻攻毒,统计发病率、死亡率.结果：F、HN融合基因诱导机体体液免疫和细胞免疫水平显著提高,攻毒后pVAX Ⅰ-F组保护率为30％,pVAX Ⅰ-HN组为46.7％,pVAX Ⅰ-F-HN组保护率为93.3％,表明F、HN融合基因DNA疫苗具有明显的免疫效果. 相似文献
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利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。 相似文献
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利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域。以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SaⅠl、NoⅠt双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性。为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 相似文献