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杆状病毒(Baculovirus)是昆虫专一性的病原病毒,是目前为止发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒.杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体,昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统. 相似文献
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在昆虫病毒中,杆状病毒(Baculovirus)是以众多的病毒粒子同时封存在一个折光性强、具有蛋白质性质、直径在0.5～10μm的多角体内为特征的。由于杆状病毒曾经直接威胁了养蚕业的发展,早在19世纪中叶就受到了人们的注意和研究。自1970年Goodwin用杆状病毒感染了昆虫细胞系,建立了第1个杆状病毒-昆虫细胞离体系统之后,人们对昆虫杆状病毒的研究不断深入。近年来,昆虫病毒的分子生物学研究进展较快,3种杆状病毒(AcMNPV、OpMNPV、BmNPV)全基因组序列已公布,为从分子进化的角度研究昆虫病毒进化的关系提供了可能。 相似文献
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为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。 相似文献
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利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染 总被引：2，自引：1，他引：1
尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。 相似文献
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将家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因与2009年3月前完成全基因组测序的49种杆状病毒DNA聚合酶基因进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析，并建立基于氨基酸序列的系统进化树。结果显示，该系统进化树支持将杆状病毒分为鳞翅目核型多角体病毒、鳞翅目颗粒体病毒、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统，且BmNPV与其他大多数核型多角体病毒同源性较高，属于鳞翅目Group I NPVs，与AcMNPV、PlxyNPV亲缘关系最近。 相似文献
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昆虫杆状病毒的生活史中令人惊奇的现象之一是其极晚期基因多角体蛋白(polyhedrin, polh)基因的超高水平表达,表达产生的多角体蛋白将病毒粒子包埋到内部形成包涵体。本文根据已有的研究结果,从3个方面概括了polh基因超高水平表达的机制,即polh启动子的结构特征和转录调控、polh mRNA的结构和翻译调控以及影响polh基因表达的蛋白调控因子,期望有助于更好地理解polh超高水平表达调控的分子机制,为提高杆状病毒表达载体系统表达外源蛋白效率提供理论指导。 相似文献
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在昆虫杆状病毒的级联复制中,极早期基因ie-1所编码的IE-1蛋白具有重要功能,其中极晚期多角体蛋白基因启动子polh受其调控激活。通过建立具有启动子polh及ie-1长194 bp的反义序列(ie-1-r)的转录载体,使杆状病毒在宿主细胞进行自身复制时受到抑制。试验结果表明,当转入重组转录载体polh/ie-1-r的宿主细胞受携带荧光素酶(luciferase)基因的杆状病毒感染时,能够被诱导激活细胞内多角体蛋白基因启动子转录其携带的ie-1的反义序列RNA,从而部分抑制病毒本身的复制,宿主细胞在病毒感染第4～5天,其荧光素含量与对照RLU(relative light unit)相比下降约1×108个单位,抑制病毒的效果在时间上呈现一定的滞后性。试验结果提示:构建类似的病毒诱导表达系统,通过早期基因激活晚期基因,晚期基因转录抑制早期基因表达的策略,可以对病毒复制进行抑制。 相似文献
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<正> 关于家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)已是研究较为深入的一种杆状病毒。家蚕细胞系统是研究病毒与宿主相互关系,病毒的特异性,病毒基因表达的理想实验材料。最令人感兴趣的是:这一材料已发展成为表达外源基因的载体宿主系统。目前国内正积极利用该材料,从事各种研究。系统地研究BmNPV在离体细胞中的复制增殖,特别是在较大规模培养细胞水平探索病毒增殖规律方面,对于进一步开发应用这一病毒资源,拓宽其应用价值是十分重要的。本文在静止培养70毫升细胞规模下,研究了BmNPV的离体增殖及其特征。 相似文献
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BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。 相似文献
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为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。 相似文献
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BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探 总被引：1，自引：1，他引：0
为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。 相似文献
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为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。 相似文献
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人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。 相似文献
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杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白(polyhedrin)是晚期高水平表达的蛋白质,对于维持病毒粒子在自然环境下的稳定性和在宿主之间的传播至关重要。PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)多角体蛋白基因polh,亚克隆到原核表达载体p ET32,获得重组质粒p ET32-polh,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株进行原核表达,诱导表达的融合蛋白带His标签,经镍柱纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗多角体蛋白的多克隆抗体。Western blot检测该多克隆抗体能够特异识别Bm NPV的多角体蛋白。利用该多克隆抗体进行免疫荧光和Western blot分析多角体蛋白的亚细胞定位及表达时相,结果显示多角体蛋白定位于细胞质,且在病毒感染后48 h才可以被检测到。该多克隆抗体可用于Bm NPV多角体蛋白的功能研究。 相似文献
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昆虫质型多角体病毒与杆状病毒多角体的结构比较 总被引：1，自引：0，他引：1
依据已有的研究结果,分析比较昆虫质型多角体病毒和杆状病毒多角体的结构差异。2种病毒都产生多角体,其中质型多角体病毒多角体的原子结构展现一个错综复杂的三聚体组装,即通过多角体蛋白分子突出的N-端螺旋臂互相连接在一起;杆状病毒和质型多角体病毒的多角体晶体相似,蛋白序列的N-末端也是α-螺旋。由此表明这2种病毒的多角体蛋白及其共同结构基础具有同源性。但一些研究表明质型多角体病毒和杆状病毒的多角体基础分子组织形成不同。尽管这2种病毒多角体含有相近的结构单位及共有对称方式,但是多角体分子在结构上差别较大,在晶体内的组装形式也不同,特别是二硫键和N-端区域的区域交叉使杆状病毒多角体的晶体构造稳定坚固,C-端臂使其结构单位相互连接在一起。有研究表明N-末端螺旋突出臂在杆状病毒和质型多角体病毒中也具有不同的结构功能,但目前并没有结构方面的证据证明这2种病毒多角体具有共同的进化起源。 相似文献
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家蚕核型多角体病毒几丁质酶基因 总被引：4，自引：0，他引：4
序列分析表明 :家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)编码的ChiA基因的ORF为 16 5 6个核苷酸 ,编码 5 5 1个氨基酸。同源性分析表明 :杆状病毒编码的ChiA基因在DNA水平上、氨基酸水平上都具有较好的同源性 ,与灵菌的ChiA在氨基酸水平上的同源性达 47 8%～ 5 8 5 % ,推测杆状病毒编码的ChiA基因由细菌通过基因的水平转移而来。在杆状病毒ChiA的系统树中 ,舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)为一单独分枝 ,处于进化树的最根部 ,其余可分 2组 ,其中棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)ChiA、谷实夜蛾核型多角体病毒 (HzNPV)ChiA为一组 ,其它杆状病毒的ChiA构成了第二组 相似文献
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苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统的建立,使数百种外源基因得到高效的表达.该系统的产业化开发如大量培养昆虫细胞,存在成本高、技术难度大等问题.建立柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus ,ApNPV)载体表达系统,是利用柞蚕蛹为宿主进行外源基因表达.我国柞蚕资源丰富,柞蚕的蛹体大,以蛹滞育越冬,能够满足工厂化生产的需求.柞蚕核型多角体病毒有3个不同亚株,本实验研究了ApNPV A株系[简称ApNPV(A)]对不同发育阶段和不同品种的柞蚕蛹的感染性,为利用柞蚕蛹表达外源基因的产业化开发奠定基础. 相似文献
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家蚕核型多角体病的抗性机制研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
家蚕核型多角体病毒(Bom byx m ori nuclearpo1yhedrosisvirus,Bm NPV)是昆虫病毒史上首先发现的,由Bm NPV引起的家蚕核型多角体病毒病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种。该病在世界养蚕业国家常有暴发,传染性极强,难以控制,危害最为严重在生产上,常造成巨大的经济损失。蚕业界学者多年来一直希望寻找抗病基因、阐明抗性机理、培育抗性品种,目前在很多领域己取得一定的进展。1杆状病毒及其侵染途径1.1杆状病毒分类及其相关基因的研究杆状病毒(baculovirus)是一类单分子双链闭合环状DNA病毒,基因组大小为88-160kb,因病毒粒子呈杆… 相似文献
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家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建 总被引：5，自引：4，他引：1
为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。 相似文献