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1.
【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。 相似文献
2.
为探究SIRT1基因在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用机制,采用荧光定量PCR方法检测不同浓度白藜芦醇和尼克酰胺处理的颗粒细胞中SIRT1基因的表达规律性,以及凋亡相关因子基因Bax、Caspase-3、Bcl-2表达量的变化,采用SPSS统计分析SIRT1基因与凋亡相关因子表达量的相关性。结果表明,一定浓度的白藜芦醇和尼克酰胺能调节猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达;SIRT1基因的表达与Bax、Caspase-3的表达呈正相关,相关系数分别为0.664和0.815;SIRT1基因的表达与细胞凋亡因子基因Bcl-2的表达相关性不显著。说明SIRT1基因可通过影响线粒体信号通路中凋亡因子的表达参与猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控。 相似文献
3.
《中国农业科学》2020,(17)
【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles,SF)是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3—4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM1, q value0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数:FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM1,P0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组:其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡(P0.01);DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡(P0.01)。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献
4.
研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。 相似文献
5.
[目的]分析去乙酰化酶SIRT1在猪不同组织中的表达规律性,为研究猪SIRT1基因功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR和Western blotting方法检测猪脑、肝脏、胰脏、脂肪、卵巢、肾脏、心脏、脾脏等组织中SIRT1基因mRNA和蛋白的表达量.[结果]在猪脑、肝脏、胰脏、脂肪、卵巢、肾脏、心脏、脾脏等组织中均有SIRT1 mRNA和蛋白表达,且以卵巢组织中的表达量最高,心脏中的表达量最低.[结论]去乙酰化酶SIRT1在猪不同组织中的表达具有一定规律性,可能与猪的脂肪代谢和繁殖活动密切相关,直接或间接调节猪的能量代谢和生殖活动. 相似文献
6.
【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献
7.
为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。 相似文献
8.
9.
【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。 相似文献
10.
【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。 相似文献
11.
构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。 相似文献
12.
[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。 相似文献
13.
为了揭示猪卵巢卵泡选择性闭锁机制,采用Real time PCR和HE染色方法,检测猪各阶段卵泡颗粒细胞中Fas和FasLmRNA表达和形态学变化;分析比较不同发育阶段卵泡中颗粒细胞Fas和FasLmRNA表达差异及细胞凋亡程度。结果表明,健康的大(5 mm)、中(3～5 mm)、小(3 mm)卵泡,早期闭锁的大、中、小卵泡以及晚期闭锁的大、中、小卵泡壁层颗粒细胞都有Fas和FasLmRNA表达。早期闭锁卵泡颗粒细胞Fas和FasLmRNA相对表达量高于健康卵泡与晚期闭锁卵泡。早期闭锁小卵泡FasLmRNA相对表达量与大、中、小健康卵泡相比均有显著差异(P0.05);状态相同的大、中、小卵泡间Fas与FasLmRNA相对表达量均无显著差异(P0.05);表明Fas/FasL系统在猪卵巢卵泡选择性闭锁过程中,对颗粒细胞凋亡具有重要的调节作用。 相似文献
14.
为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。 相似文献
15.
【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。 相似文献
16.
为研究牛卵泡发育过程中促进卵泡生长成为优势卵泡的重要调控因子及其表达模式,采集牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8 mm),通过测定卵泡液中雌二醇(E_2)与孕激素(P)的水平,确定优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)。刮取DF和SF中的颗粒细胞,提取其总RNA并建立文库,通过Illumina平台进行测序。用SOAP V2.0软件将测序获得的序列与牛参考基因组数据库进行比对,获得mRNA序列;用DESeq 2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,并对其中表达上调的基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最后通过实时荧光定量PCR对筛选出的具有代表性的上调表达基因进行验证。通过测序共获得32 346个基因,其中在DF颗粒细胞中表达显著上调的基因有194个。GO分析结果显示,这些表达上调的基因共分为3大类33组,其中参与生物学过程(Biological process)的基因占60.6%;与细胞组分(Cellular component)相关基因占21.2%,其中31个基因参与了细胞质功能;与分子功能(Molecular fuction)相关的基因占18.2%,其中18个基因参与金属离子结合。KEGG信号通路分析共发现4条通路,其中基因富集最为显著的是轴突导向通路。实时荧光定量PCR结果表明,细胞色素P450 19A1基因(CYP19A1)在DF颗粒细胞中的相对表达量极显著高于SF(P0.01),硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、脑表达X2(BEX2)和丝氨酸蛋白酶35(PRSS35)基因在DF颗粒细胞中的相对表达量显著高于SF(P0.05),与Illumina测序表达趋势一致。综上,PRSS35、CYP19A1、BEX2和TXNIP在牛卵泡的发育过程中可能会起促进作用,最终引起卵泡排卵。 相似文献
17.
为探讨YAP1基因在鸡卵泡生长发育中的调控作用,以150 d海兰褐蛋鸡为供试材料,采用相对定量RT-PCR方法对YAP1基因在鸡卵巢组织不同发育时期卵泡中的mRNA转录水平进行检测分析,并用免疫组织化学方法对YAP1蛋白质分子在鸡前等级卵泡中的时空表达模式进行蛋白定位分析。结果表明:鸡YAP1基因mRNA在卵巢间质、前等级卵泡和不同等级化的卵泡中均有表达,但在不同等级的卵泡中表达差异不显著(P0.05),呈现出组成型表达的特点。鸡YAP1蛋白质分子主要在卵巢间质组织、前等级卵泡卵母细胞和颗粒细胞中有表达,但在膜层细胞中未检测到其表达信号。此结果表明,YAP1分子可能主要以自分泌或旁分泌的方式在前等级卵泡的生长发育过程中发挥着重要调节作用。 相似文献
18.
《南京农业大学学报》2014,(6)
为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P0.05)与极显著(P0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。 相似文献
19.
[目的]探讨BMP15蛋白在兔卵巢卵泡发生过程中的调控机制。[方法]采用免疫组织化学方法测定了BMP15在兔卵巢中的表达定位情况。[结果]BMP15蛋白在原始卵泡中没有表达,在初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡卵母细胞及有腔卵泡颗粒细胞和卵泡液中均有表达,在黄体溶解早期也有表达,但是在闭锁卵泡中的表达则受到抑制。[结论]BMP15参与了兔卵泡发育全过程,并且与黄体溶解机制有关;而在闭锁卵泡中,其低水平的表达可能是由其他因子所抑制,进而共同调节了卵泡的闭锁。 相似文献
20.
选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞.采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl-2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96 h,用流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF-1的含量.结果发现,转染Bcl-2重组质粒组的Bcl-2蛋白表达量和IGF-1分泌量均多于其他各组.分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF-1分泌量减少,而F4的IGF-1分泌量基本不变.结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl-2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF-1的作用;鸡卵泡颗粒细胞IGF-1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响. 相似文献