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1.
利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）分别建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）与温和气单胞菌（A.sobria,AS）的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL^-1和320 fg·mL^-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。 相似文献
2.
根据NCBI公布的柱状黄杆菌硫酸软骨素裂解酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测柱状黄杆菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,同时测试该体系的特异性和灵敏度,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的138bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为pg级,对柱状黄杆菌的检测灵敏度为25cfu/20μl。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了柱状黄杆菌常规PCR检测体系,该体系可以用于柱状黄杆菌的诊断和样品的检测。 相似文献
3.
为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。 相似文献
4.
应用2对特异性引物,通过对反应条件和体系的优化,成功建立了能快速检测维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌两种病原的双重PCR方法。研究结果表明,该方法特异性强,仅对龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌有扩增,而对其他龟鳖常见病原无扩增;该方法对维氏气单胞菌最低检测核酸质量浓度为1.75×10-3 ng/μL,对鲍曼不动杆菌最低检测核酸质量浓度为3.96×10-3 ng/μL,检出率较传统检测方法高。该研究所建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性好,可为临床龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌感染的诊断和流行病学调查等提供帮助。 相似文献
5.
杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检 相似文献
6.
《水产科学》2021,(4)
为提高罗非鱼链球菌病发前的早期预警,根据海豚链球菌的16S rRNA基因的部分序列和无乳链球菌的Sip基因特异性序列,分别合成特异性检测引物,经过对反应体系和反应条件的优化,建立检测较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的分子技术。试验结果显示,所建立的双重PCR可扩增出870 bp无乳链球菌和614 bp海豚链球菌的特异性片段,而迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌均为阴性;无乳链球菌和海豚链球菌基因组DNA最低检测量分别为9.84×10~(-5) ng/μL和9.30×10~(-5) ng/μL,菌液最低检测量分别为2.76×10~3 cfu/mL和2.51×10~3 cfu/mL,远低于其半致死密度10~7 cfu/mL;对无乳链球菌和海豚链球菌混合感染的模拟临床样品的检出率为100%。研究结果表明,该分子技术的特异性较强、灵敏度较高、检出率较高,可用于较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,为罗非鱼链球菌的早期预警分子检测提供技术支持。 相似文献
8.
利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不同种的细菌,检出效率可达103CFU/g。统计分析显示,变异系数为0.21%-0.80%,均小于5%,表明重复性良好。 相似文献
9.
致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。 相似文献
10.
根据NCBI公布的爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)磷酸丝氨酸转氨酶(phosphoserine transaminase,serC)的基因序列,设计一对特异性引物,建立了可快速而准确地检测爱德华氏菌的PCR方法,并对患病鱼组织进行了检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小一致的124 bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为50 pg/反应,对靶标细菌的检测灵敏度为56 cfu/反应。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明成功建立了爱德华氏菌常规PCR检测方法,可用于爱德华氏菌病的诊断。 相似文献
11.
肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒是常见的2种DNA对虾病毒,在虾类养殖业中经常会出现混合感染。因此,建立这2种病毒的复合检测方法显得尤为重要。根据基因库中肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的保守序列,设计了肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的特异性引物,对这2种病毒PCR复合检测的反应条件和试剂浓度进行优化,退火温度55℃,主要试剂Mg2+终浓度为3mmol/L,dNTP终浓度为0.4 mmol/L,引物终浓度为0.8μmol/L。进一步比较了在优化后的PCR反应体系下,检测单种病毒和同时检测这2种病毒的灵敏度差异。 相似文献
12.
根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。 相似文献
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奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。 相似文献
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PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌 总被引：14，自引：0，他引：14
根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。 相似文献
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为建立十足目虹彩病毒1的快速检测方法,根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(ORF114R)保守序列设计特异性引物,通过条件优化,建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒1检测方法。重组酶聚合酶扩增技术的最优扩增温度为30 ℃,恒温反应20 min内即可完成。特异性试验结果显示,该方法与其他常见虾类感染病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法对十足目虹彩病毒1的最低检出限为7 拷贝/μL,低于传统的巢式PCR方法。利用已建立的重组酶聚合酶扩增技术方法和PCR方法对采集的509批临床样品进行检测,试验结果表明,重组酶聚合酶扩增技术能够有效检出PCR方法的弱阳性样品,表明重组酶聚合酶扩增技术可以用于临床检测。笔者建立的检测十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术具有快速、简便、特异性强、灵敏度高的特点,适合基层实验室及现场检测。 相似文献
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鰤鱼诺卡氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。 相似文献