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1.
[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原 相似文献
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[目的]采用原核表达技术对甜菜夜蛾的黄素单加氧酶(FMO)进行体外表达,获得具有活性的FMO酶,在此基础上开展对杀虫剂的代谢功能研究。[方法]通过将甜菜夜蛾FMO基因的开放阅读框构建到pET32a原核表达载体中,在大肠杆菌中表达目的蛋白,利用该载体的His标签使用镍柱对表达蛋白进行纯化,再通过咪唑梯度洗脱得到纯化的重组FMO酶蛋白。采用还原型辅酶Ⅱ(NADPH)法测定FMO酶的活性以及对杀虫剂的氧化活性,并用HPLC法分析FMO酶催化杀虫剂降解的能力,最后用液质联用技术鉴定代谢产物。[结果]通过原核表达技术成功得到可溶性的SeFMO2与SeFMO3酶,这2种酶对FMO的模式底物甲巯咪唑与苄达明均具有氧化活性,SeFMO2与SeFMO3对甲巯咪唑S-氧化的代谢动力学参数K_m值分别为37.59与3.00μmol·L~(-1),对苄达明N-氧化的K_m值分别为165.98与17.71μmol·L~(-1)。对模式底物的S-氧化活性与N-氧化活性均是SeFMO3高于SeFMO2,2种酶的S-氧化活性均高于N-氧化活性。SeFMO2和SeFMO3对毒死蜱、硫双威以及溴虫腈具有一定的代谢活性,HPLC分析表明这2种FMO酶均能催化这3种杀虫剂的氧化降解,SeFMO2对毒死蜱、溴虫腈和硫双威的降解率依次是11.8%、11.5%和27.8%,SeFMO3对它们的降解率分别是28.8%、23.1%和30.2%,其中对硫双威的降解作用较强。对硫双威代谢产物的鉴定表明:FMO主要催化硫双威的硫醚氧化,形成硫双威的砜化合物。[结论]甜菜夜蛾黄素单加氧酶对外源物具有S-氧化活性与N-氧化活性,对某些杀虫剂具有氧化代谢能力,是昆虫的重要解毒酶系之一。 相似文献
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《甘肃农业大学学报》2017,(6):134-140
【目的】研究草氨酸钠抑制剂对冷却肉中乳酸脱氢酶活性(LDH)及表面肉色的影响.【方法】从牛胴体上取背最长肌,随机分成两组,一组肌肉喷射草氨酸钠,一组不做任何处理.在4℃下冷藏7d,每隔2d分别测定肉色、色素含量、pH值、NADH浓度、乳酸脱氢酶和高铁肌红蛋白还原酶活性等指标.【结果】草氨酸钠处理组a*值显著低于对照组,b*值差异不显著,L*值没有差别,总色素含量呈下降趋势.含有草氨酸钠的肌肉中LDH,NADH浓度显著降低(P<0.05),相关性分析表明LDH活性,NADH浓度及高铁肌红蛋白还原酶(MetMbR)活性之间存在显著的正相关(P<0.05).【结论】证实了草氨酸钠抑制了乳酸脱氢酶的活性,导致NADH的浓度和MetMbR活性降低,从而维持肉色的稳定性. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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强酸性阳离子交换树脂催化制备乳酸乙酯研究 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]研究强酸性阳离子交换树脂NKC-9催化制备乳酸乙酯。[方法]以乙醇、乳酸为原料,以强酸性阳离子交换树脂为催化剂,间歇催化合成乳酸乙酯;通过正交试验,考察了反应温度、催化剂用量、酸醇摩尔比对合成乳酸乙酯的影响;并通过重复试验考察了该催化剂的活性。[结果]在不分离产物情况下,制备乳酸乙酯的优化条件为：反应温度为85℃,酸醇摩尔比为0.5∶1,催化剂用量（以乳酸加入质量计）为5%,反应时间为1h,乳酸的转化率达42.48%。[结论]该研究为乳酸乙酯的生产工艺研究提供了理论依据。 相似文献
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[目的]本文旨在探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对睾丸支持细胞(Sertoli cells,SC)乳酸产生的影响,[方法]以Wistar大鼠SC为研究材料,采用不同浓度的ZEA(0、0.1、1、10、20、30μmol·L~(-1))处理24 h,利用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测试剂盒检测ZEA对SC的毒性作用;乳酸测试盒检测ZEA对SC内、外乳酸产生的影响;丙酮酸测试盒检测ZEA对SC内丙酮酸产生的影响; Western blot检测SC乳酸代谢通路相关蛋白的表达;免疫荧光法检测乳酸产生关键酶LDH荧光强度的改变。[结果]随着ZEA浓度的增加,ZEA对SC的细胞毒性逐渐增大(P0.01);与对照组相比,染毒组细胞内、外乳酸含量和细胞内的丙酮酸含量显著或极显著下降(P0.05或P0.01),葡萄跨膜糖转运蛋白1(GLUT1)和乳酸脱氢酶(LDH)在1、10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量极显著降低(P0.01);单羧酸转运蛋白4(MCT4)在30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量呈显著降低(P0.05);免疫荧光检测结果表明,LDH的荧光强度随着染毒浓度增加而降低,与对照组相比,10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组细胞内的蛋白表达量均极显著下降(P0.01)。[结论]ZEA可以抑制SC乳酸产生,干扰SC对生殖细胞的能量供应,进而对雄性生殖功能产生损伤。 相似文献
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《江苏农业学报》2014,(1)
为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pLEB590-SQR的构建及其在乳酸乳球菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切载体pLEB590与目的片段SQR,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过电转化法转化到乳酸菌中,提取所得到的乳酸乳球菌质粒pLEB590-SQR进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸乳球菌MG1363中,在含有Nisin(乳酸链球菌素)的选择培养基中筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE电泳和Western杂交检测SQR蛋白质的表达情况。最后检测重组质粒在MG1363中的遗传稳定性。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pLEB590-SQR构建成功,从MG1363中成功检测到目的蛋白质SQR的表达,携带pLEB590-SQR的MG1363遗传稳定性达90%以上。乳酸乳球菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。 相似文献
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构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。 相似文献
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[目的]制备重组蛋白PACAP-PTD,并对其活性进行鉴定。[方法]设计编码融合蛋白PACAP-PTD基因,克隆到表达载体pKYB,构建重组表达载体pKYB-PACAP-PTD,转化大肠杆菌ER2566中。采用IPTG诱导由PACAP-PTD、内含肽和几丁质组成的融合蛋白表达。利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)介导的纯化系统制备目的融合蛋白PACAP-PTD,并对其活性进行鉴定。[结果]试验所得的目的蛋白经测定分子量,结果与理论值相符,且试验中PACAP-PTD能有效的穿越血脑屏障。[结论]融合蛋白PACAP-PTD的构建和制备为其生物学功能的深入研究奠定了基础,同时可用于改善其用药途径,扩大其应用范围。 相似文献
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[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。 相似文献
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牦牛乳酸脱氢酶-1两种遗传变异体的纯化及酶学特性比较 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】从乳酸脱氢酶（LDH）水平上探索牦牛(Bos grunniens)低氧适应性分子机制。【方法】利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析牦牛组织中LDH同工酶谱;用比色法测定牦牛、黄牛和水牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力;采用染料亲和层析和DEAE-Sephadex离子交换层析从牦牛心肌组织中纯化LDH1（由4个H亚基组成）的2种遗传变异体,进行酶学性质的比较。【结果】电泳方法检测发现牦牛LDH1存在2种遗传变异体,根据电泳迁移率分别命名为快型和慢型（LDH1-F和LDH1-S）。获得纯化的牦牛LDH1-F和LDH1-S,比活力分别为21.4 U?mg-1蛋白和17.8 U?mg-1蛋白,在SDS-PAGE和PAGE上均显示1条区带。2种变异体以NADH为底物的米氏常数（Km）值差异不大,均显著高于普通牛的LDH1;以丙酮酸钠为底物的Km值LDH1-F小于LDH1-S。试验进一步比较了携带不同LDH1变异体的牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力和各种同工酶谱,未见显著差异,而牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力显著或极显著低于黄牛和水牛。【结论】牦牛LDH1 2种遗传变异体的Km值存在差异,且Km(NADH)高于普通牛;牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力低于普通牛。 相似文献
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[目的]探讨小鼠实验性缺氧脑和肺组织丙二醛、乳酸含量和乳酸脱氢酶活性变化。[方法]将18只小鼠随机分为3组:正常对照组、急性缺氧组、急性一氧化碳染毒组,测定脑和肺组织MDA、LD含量、LDH活性。[结果]急性缺氧组和急性一氧化碳染毒组小鼠脑和肺组织MDA和LD含量显著增高。与对照组相比,急性缺氧组和急性一氧化碳染毒组小鼠肺组织中LDH活性显著降低,而在脑组织无显著性变化。MDA和LD含量在缺氧早期,脑和肺组织是易变化性指标,其改变可能与该组织损伤程度有关。LDH变化说明肺组织比脑组织对缺氧产生的自由基损伤更敏感。[结论]该模型为畜牧生产和水产养殖中出现的机体缺氧提供理论依据和实践指导。 相似文献
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牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化、酶学性质及其基因的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】分离纯化牦牛骨骼肌中的乳酸脱氢酶-A（LDH-A）,并克隆其cDNA。通过比较牦牛与普通牛的LDH-A的酶学性质和cDNA序列,为研究牦牛适应高海拔、低氧环境,在分子水平上找到一些线索。【方法】采用染料亲和层析和DEAE-Sephadex离子交换层析等方法,分别从牦牛和普通牛骨骼肌中纯化LDH-A,并对其酶学性质进行比较;通过RT-PCR方法克隆牦牛LDH-A的cDNA序列,并与GenBank登录的普通牛LDH-A的cDNA序列进行比对。【结果】纯化的牦牛LDH-A比活力为103.9 U•mg-1蛋白,纯化倍数为18.2。SDS-PAGE和PAGE分析均显示一条带。酶动力学参数测定显示,牦牛LDH-A的Km NADH为0.097,Km 丙酮酸钠为1.897,均不同程度高于普通牛,其中对丙酮酸钠的Km大约是普通牛的2倍。根据牦牛LDH-A的cDNA序列预测的氨基酸序列与普通牛LDH-A的氨基酸序列比较,只有2个氨基酸残基的改变（257Val-Ala和315Tyr-Cys）。【结论】牦牛LDH-A对丙酮酸的高Km可避免骨骼肌中产生过多的乳酸,是适应进化的结果;这种升高可能与其氨基酸序列变化导致的空间结构微小改变有关。 相似文献
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[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人肝细胞（L02）损伤的保护作用。[方法]通过测定细胞存活率及细胞培养上清液中转氨酶（ALT、AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、MDA含量及SOD活性,研究EGCG对L02损伤的保护作用。[结果]与对照组相比,肝细胞损伤模型组的SOD活性显著降低,MDA含量极显著升高,EGCG各剂量组均可显著降低MDA含量,其培养上清液中ALT和LDH含量显著升高。与模型组相比,EGCG 1.25×10^-5、2.50×10^-5、5.00×10^-5和1.00×10^-4mol/L剂量组的细胞培养上清液中ALT含量显著降低,且EGCG 2.50×10^-5、5.00×10^-5和1.00×10^-4mol/L剂量组的细胞培养上清液中LDH含量显著降低;EGCG 1.25×10^-5和2.50×10^-5mol/L剂量组可使SOD活性极显著增加,EGCG 5.00×10^-5和1.00×10^-4mol/L剂量组可极显著降低MDA含量。[结论]EGCG可减轻CC l4及H2O2所致的肝细胞氧化损伤,对肝细胞具有保护作用,并具剂量依赖性。 相似文献
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[目的]探讨三硝基甲苯(TNT)对斑马鱼(Danio rerio)组织中酶活性的影响,为评价TNT的毒性效应提供参考。[方法]采用毒性试验方法研究了不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的TNT对斑马鱼肝和鳃中ATP酶、头中乳酸脱氢酶(LDH)和肝中谷胱甘肽(GSH)活性的影响。[结果]肝和腮组织中的ATP酶活性随浓度的升高而降低;肝中GSH的活性随浓度的升高而升高;头中LDH活性随浓度的升高而降低。酶活随时间的变化规律和随不同浓度的变化规律相同,但变化缓慢。[结论]用斑马鱼肝和腮组织中酶活性作为毒理学指标能较好地评价TNT的毒性效应。 相似文献
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雷氏七鳃鳗LDH与SOD同工酶的电泳分析 总被引：3，自引：1，他引：2
[目的]为对圆口纲动物雷氏七鳃鳗的深入研究及开发利用提供基础的生理生化指标依据。[方法]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法对雷氏七鳃鳗肌肉、肠、生殖腺、肝4种组织中乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）同工酶位点及其酶谱表型进行了研究。[结果]雷氏七鳃鳗不同组织中LDH同工酶呈二带型分布,肌肉和生殖腺中有2条带,而肠和肝中只呈现1条带;不同组织中SOD同工酶的谱带分布特点是：肌肉10条,肠10条,生殖腺9条,肝12条。[结论]SOD和LDH同工酶在雷氏七鳃鳗4种组织中表达存在明显的组织特异性。 相似文献
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不同海拔地区牦牛组织线粒体LDH活性测定 总被引：4，自引：0，他引：4
[目的]进一步探讨高原动物对高原低氧的适应机制。[方法]测定青海省玛多县(海拔4300 m左右)和刚察县(海拔3 300 m左右)牦牛心肌、骨骼肌线粒体中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。[结果]玛多县和刚察县牦牛心肌、骨骼肌线粒体的乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为(2472.40±276.58)、(2448.71±494.69)、(3855.07±316.44)、(3882.62±602.87)U/gPro;玛多牦牛的心肌、骨骼肌线粒体中的LDH活性极显著低于刚察牦牛(P<0.01)。[结论]在高原低氧环境下,牦牛随海拔高度升高对无氧代谢的依赖性降低。 相似文献
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韩雅莉 《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》1992,(4)
本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合光密度扫描的方法,对中国林蛙6种组织器官的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行分析研究,结果表明:存在3种基因(Ldh-A、-B、-C)编码的LDH 同工酶;在不同组织中 LDH 同工酶差异显著,其中心肌以 LDH_2、LDH_1活性最高,骨骼肌、肝脏以及脑组织以 LDH_5活性最高,LDHc 仅出现在肝脏及骨骼肌中。 相似文献