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为了弄清目前建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)病毒检测和脱毒的研究概况,本研究详细阐述了2种病毒的检测方法、采用的脱毒技术和脱毒效率,分析比较了不同技术存在的弊端,指出现有的脱毒方法已不能满足兰科植物脱毒研究的需要。在此基础上,进一步提出应采用安全、可靠的新型脱毒技术来解决目前兰科植物产业瓶颈问题。超低温脱毒技术是近年来发展迅速的脱毒技术,具有独特优势,目前已在多种植物上成功应用,该方法的应用有望解决2种病毒脱毒方面存在的问题。 相似文献
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为了实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X（PVX）和Y病毒（PVY）,利用胶体金标记和免疫层析技术研制了PVX-PVY双重检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,在波长526nm处有最大吸收值,金颗粒直径约25nm。同时标记PVX和PVY兔多克隆抗体,将抗体标记物喷射于玻璃纤维纸上,作为金标垫。将PVX和PVY抗体分别划线于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线,制备胶体金试纸条。结果表明,研制的双重试纸条能够在2min之内同时检出PVX和PVY。PVX病汁液检测稀释限度可达106倍（W/V）,PVY可达105倍（W/V）,其中对PVX检测更灵敏。用其他4种常见病毒（PVS、PLRV、PVA和PVM）检测,未出现交叉反应。在田间采集马铃薯叶片,分别利用试纸条与DAS-ELISA检测,结果一致性非常高。由此可知,该试纸条具有操作简便、反应快捷的特点,特别适用于田间及口岸一线对于马铃薯X和Y病毒的同时检测。 相似文献
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SNPS在大豆等作物遗传及改良中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指DNA序列上的单个碱基变异,它具有分布广、多态信息量大、易于检测和统计分析等优点,被称为继RFLP和微卫星标记后的第三代基因遗传标记。单核苷酸多态性是等位基因间序列差异最为普遍的类型,可作为一种高通量的遗传标记。已建立PCR扩增目标序列及其产物测序和电子SNP(eSNP)等多种发现和检测SNP的方法。大豆等作物也已开展了SNP分析。一些栽培作物种质的多样件不断减少,其结果连锁不平衡(linkagedise鄄quilibrium,LD)增加,这有利于目的基因座上SNP单元型(haplotype)与表型的相关性分析。SNP已在作物基因作图及其整合、分子标记辅助育种和功能基因组学等领域展示了广泛的应用价值。 相似文献
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梨树组织中的苹果锈果类病毒原位RT-PCR检测 总被引：3，自引：0，他引：3
利用自行设计的方法分离提取总RNA,通过一对特异引物,分别扩增出不同梨树品种上苹果锈果类病毒（ASSVd）的特异片段,经由回收、克隆和测序,有10条序列已在GenBank（EU031467-EU031476）登录,利用克隆的ASSVd质粒,通过RT-PCR合成了生物素标记的cDNA探针,建立了斑点杂交检测技术。在此基础上以已知带有苹果锈果类病毒的库尔勒香梨和无类病毒梨树叶片为材料,利用DIG标记,研究了梨树类病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括SuperScriptⅡ浓度、4种碱基混合物（dNTPs）、RNA酶抑制剂（RNasin）及互补引物浓度对cDNA合成的影响,退火温度、LA Taq DNA聚合酶、Mg^2＋、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。研究结果表明：RNasin的用量大于0.2U/μL时,信号强度随着RNasin量的加大而增强;只有当dNTPs浓度达0.4mmol/L时才能生成一定量的cDNA;SuperScriptⅡ浓度在0.5～1.3U/μL均可进行正常的逆转录,而且在该范围内产物的量随SuperScriptⅡ浓度提高而增多;引物浓度达到0.9μmol/L以上时才能进行有效的逆转录,并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ASSVd的cDNA适合退火温度为62℃。循环30～35次可出现较强的蓝色信号,引物浓度在0.8～1.2μmol/L时显色较好;LA Taq酶浓度为0.004U/μL以上,均显示较深的蓝色;Mg^2＋浓度为1.5mmol/L就可满足原位PCR所需。 相似文献
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萝卜抽薹性研究的AFLP体系建立与优化 总被引：1，自引：1，他引：0
摘要：本研究以萝卜‘春雪总太’为优化材料,对AFLP体系的酶切时间,相关酶、Mg2+、dNTPs的用量,模板稀释倍数以及扩增循环数等6个重要影响因素进行摸索和优化,建立了适合萝卜抽薹紧密连锁基因研究的AFLP分子标记体系。结果表明：在20μL酶切体系中,将400ng的样品DNA用各0.2μLEcoR I和MseI 37℃双酶切10min, 65℃灭活10min;向 5μL酶切产物中加入EcoR I接头和MseI接头各0.5μL,用0.5μL的T4连接酶在20μL的体系中22℃连接过夜;向5μL稀释5倍后的连接产物中加入预扩引物各0.6μL,Mg2+1μL,dNTPs1.5μL,Taq酶0.2μL,ddH2O补齐至15μL,预扩增35个循环;取5μL稀释20倍后的预扩增产物,其他成分用量同预扩增相同,用ddH2O补齐至15μL进行选择性扩增。并将此优化体系在秋白、秋青、春白、秋红、水萝卜五种生态型的16份萝卜材料上进行了验证,电泳条带清楚,多态性强。 相似文献
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梨AFLP分子连锁图谱的构建与分析 总被引：2，自引：1，他引：1
遗传图谱是数量性状基因定位、基因图位克隆及分子辅助育种等研究的基础,而目前国内在梨树上这方面的研究尚属空白.试验以早美酥×八月红的杂交F1 92株实生苗为作图群体,采用了扩增稳定、多态性丰富的16对Mse I/EcoR I引物组合,对分离群体进行AFLP多态性检测,共获得208条多态性带,其中偏离孟德尔遗传的比率29.8%(P<0.01).应用Joinmap 3.0软件且结合"双假测交"策略,对208个AFLP分子标记进行了遗传连锁分析,构建了一张包含145个AFLP标记,分属20个连锁群的梨分子遗传连锁图谱,每个连锁群包含4～20个标记,平均为9.06个标记,图谱总长度覆盖梨基因组618.7 cM,标记间平均图距为6.58 cM.此图谱为梨树基因定位、比较基因组学和重要农艺性状的QTL定位等研究奠定了基础. 相似文献
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为探索冬小麦抗寒性的分子机制,以168个花培3号×豫麦57的双单倍体株系为作图群体,利用已构建含有324个SSR标记的遗传图谱,对电导法测定低温(−18℃)处理后的叶片膜透性进行QTL定位。利用完全区间作图法,在3种环境下共检测到21个与叶片膜透性相关的加性QTLs,分布于1B、2A、3A、3B、5B、6A、6B、6D、7B和7D染色体上,其中4个位点(qCMP-1B-1、qCMP-3B-2、qCMP-5B-1和qCMP-5B-4)遗传贡献率大于10%,属主效基因,其余QTL的遗传贡献率较小,属微效基因。3种环境条件下在5B染色体的Xgwm213–Xswes861.2区间检测到共同位点,与Xswes861.2的遗传距离为0 cM,其中qCMP-5B-1 (环境1)和qCMP-5B-4 (环境3)的贡献率高达17.5%和14.0%。研究结果对于小麦抗寒标记选择和抗寒育种具有应用价值。 相似文献
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利用Mudgo/武育粳3号F2群体分析水稻抗灰飞虱QTL 总被引：1，自引：0，他引：1
灰飞虱是我国水稻生产上的重要害虫。Mudgo是一个高抗灰飞虱的籼稻品种,对灰飞虱具有强的排驱性和抗生性抗性。利用Mudgo/武育粳3号F2群体,构建了含有177个单株的F2群体的遗传连锁图谱。该连锁图包含104个SSR标记和3个Indel标记,覆盖整个水稻基因组1 409.9 cM,每两个标记之间的平均距离为13.2 cM。采用改进的苗期集团筛选法对177个F2:3家系进行了抗性鉴定,通过Windows QTL Cartographer 2.5进行复合区间作图分析,在第2、3、12染色体上分别检测到抗灰飞虱QTL Qsbph2b、Qsbph3d和Qsbph12a,分别位于标记RM5791~RM29、RM3199~RM5442和I12-17~RM333 1之间,单个LOD值分别为3.25、3.11和6.82,贡献率分别为17.3%、15.6%和35.8%,各QTL增强抗性的等位基因效应均来自Mudgo。其中Qsbph12a与标记RM3331和I12-17紧密连锁。结合表型鉴定的结果,Qsbph12a应为抗灰飞虱主效QTL,与该位点紧密连锁的标记可用于抗灰飞虱快速选择辅助育种。 相似文献
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中国荷斯坦牛TLR2基因遗传多态性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以297头中国荷斯坦奶牛为研究对象,以TLR2(Toll like receptor 2)基因为目的基因,扩增目的片段,结合测序结果采用PCR-RFLP和CRS-RFLP技术方法来检测TLR2基因第2外显子的遗传多态性.结果发现:exon 2存在10098(T/G),10111(G/A)和11541(C/T)3个单核苷酸突变,其中11541位点的T/C突变为首次报道.分别选择EcoR V、HaeⅢ、DraⅠ等3种限制性内切酶检测其多态性.10098位点有3种基因型(AA,AB,BB),A、B等位基因频率分别为0.784 5,0.215 5;10111位点有2种基因型(CC,CD),C、D等位基因频率分别为0.985 8,0.014 2;11541位点有3种基因型(EE,EF,FF),E、F等位基因频率分别为0.099 3,0.900 7.10098位点T-G碱基突变导致天冬氨酸突变为谷氨酸(Asp63Glu),10111位点G-A碱基突变引起甘氨酸突变为丝氨酸(Gly68Ser).TLR2基因外显子2上的3个位点基因型在研究群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(p＞0.05).10098,10111,11541 3个位点的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数分别为0.280 9/0.338 1/1.510 8,0.027 9/0.027 9/1.028 7和0.143 4/0.178 9/1.217 9.10098位点达到中度多态,其余2个位点处于低度多态.TLR2基因可作为候选遗传标记,进行深入研究. 相似文献
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齿兰环斑病毒CP基因的原核表达及其产物抗血清制备 总被引：3，自引：2，他引：1
本研究在于探讨侵染兰花的重要病毒之一齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）的检测技术。从福建省漳州市采集感染齿兰环斑病毒的建兰病样,设计一对特异性引物扩增并克隆得到该病毒的外壳蛋白基因,该基因开放阅读框长477 bp,编码158 aa约合18.0 kDa的蛋白质,随后将目的基因插入pET-29a（+）中构建相应的原核表达载体进行诱导表达,目的蛋白经纯化后免疫家兔获得了特异性抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ORSV外壳蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附检测结果表明,抗血清可检测病叶的最低稀释度达1:25600（v/v）,最佳工作浓度为1:12800（v/v）,病汁液灵敏度为0.195 mg/mL（w/v）,而与TMV等11种同源或异源病毒均无明显的血清学交叉反应。 相似文献
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为临床上能快速诊断虎流感,通过对已分离获得的虎源H5N1流感病毒和GenBank中报道的A型H5N1亚型流感病毒的NP、HA、NA序列,设计合成各个基因的特异性PCR扩增引物和A型流感病毒通用反转录引物。通过优化反应体系及条件,建立一步法可同时扩增出3个基因的联合RT-PCR检测方法。将该方法用于临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法进行比较。结果,NP、HA、NA基因的扩增片段大小分别为464bp、581bp、173bp,其检测的敏感性约100个TCID50。该方法的检出率和病毒分离结果相符,高于电镜负染和HA/HI试验。结果显示,该方法可用于虎源流感病毒的临床或实验室检测。 相似文献
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Current techniques to identify wheat lines possessing the 1RS chromosome are generally unsuitable in relation to the speed and cost needs in modern wheat breeding programmes. A gel-free, direct amplicon capture PCR-ELISA assay was developed and evaluated, aiming at speeding the identification of wheat genotypes possessing the 1RS chromosome arm in breeding programmes. The chosen target sequence was the repetitive, interspersed rye-specific element RIS-1. Primers were end-labelled with digoxigenin and biotin, and amplicons captured on to straptavidine-coated microplates. Subsequent immunodetection of the digoxigenin moiety readily distinguished 1RS from non-1RS control genotypes tested. When a nursery consisting of 120 winter and spring wheat lines was screened by PCR-gel electrophoresis and the PCR-ELISA, a perfect agreement between both techniques was observed. Test robustness, as measured by the tolerance to variations in DNA input, was better for PCR-ELISA than PCR-gel electrophoresis. In conclusion, a simple, robust, fast and scalable technique for the detection of 1RS chromosome carriers in wheat breeding programmes is now available. 相似文献
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为明确陕西省甘薯病毒病害发生范围及严重程度等，以陕西省西安、咸阳、渭南、榆林、商洛、安康和宝鸡等7市采集到的98个疑似甘薯病毒病害样品，用多重RT-PCR检测方法对甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease, SPVD)进行快速检测。结果显示，样品病毒总检出率为52.04%，38个样品检测到甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)，占38.78%；25个样品检测到甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)，占25.52%；检测到病毒的51个样品中，有38个样品为单一病毒侵染，13个样品为两种病毒复合侵染，即SPVD检出率为13.27%；除咸阳市没有检出SPFMV-CH2株系外，其余6个地市均检测到SPCSV及SPFMV-CH和CH2株系。46个育种材料中，2个材料检测到SPCSV，检出率为4.35%。说明SPVD已在陕西省普遍发生，且发病情况较为严重。 相似文献
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2010年4月从河南省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到一株病毒。通过SPF鸡胚致侏儒实验,鸡红细胞凝集试验,干扰新城疫病毒增殖试验和RT-PCR试验确认该病毒为一变异的鸡传染性支气管炎病毒。该病毒尿囊液凝集鸡红细胞的HA价为0,经胰酶处理后为27;EID50（鸡胚半数感染量）为10－5.5/0.1 mL;能够显著干扰鸡新城疫病毒La Sota株在鸡胚中的增殖;动物回归试验结果显示该病毒可致SPF雏鸡出现肾脏肿大,呈花斑肾。其S1基因全长为1617 bp,经序列分析发现与鸡传染性支气管炎疫苗Massachusetts株、T株、4/91株亲缘关系较远低于78%。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV) N基因序列（FJ767920）,利用引物软件Premier5.0,设计并合成了1对特异引物,通过对RT-PCR扩增条件的优化,建立了一种快速检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法成功地从IBV M41和河南株HN99中扩增出318 bp的目的片段,而传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。将回收的RT-PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体后测序,进一步证实RT-PCR检测方法的特异性。对IBV的最低检出量为0.6 pg的cDNA。经临床初步应用表明,本方法的建立对IBV的早期诊断和临床检测具有快速、灵敏、特异、经济的特点。 相似文献