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天门冬AFLP反应体系的建立及优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为探讨天门冬种质间遗传多样性奠定基础,采用单因子试验,建立并优化了天门冬AFLP反应体系,研究酶的用量、酶切时间、预扩增体系和选择性扩增等对PCR扩增的影响。酶切反应体系加入5.0 U EcoR I和Mse I于37℃保温3 h;连接反应体系加入1.0 U T4-DNA连接酶、2.0 pmol Mse I接头和2.0 pmol EcoR I接头,16℃保温过夜;选择性扩增反应体系加入1.0 U Taq DNA聚合酶,0.4 μL EcoR I和Mse I选择性引物;并筛选得到了8对清晰、多态性高的AFLP引物。17份天门冬种质对建立的AFLP反应体系检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬种质多样性的分析。 相似文献
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本研究以大麻嫩叶为材料,以改进的SDS法,提取了高质量的大麻基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验条件的优化,建立了AFLP反应体系。研究结果表明:在常规的SDS提取液里加入8μL/mLβ-巯基乙醇(V/V)和3%PVP(M/V)能够提取到高质量的适用于AFLP的基因组DNA;选取150ng大麻基因组DNA来进行酶切,EcoRⅠ和MseⅠ各0.5U,在37℃酶切4h,即可完全酶切。最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0U Taq DNA polymerase、1.0μL25mmol/L Mg2+、0.4μL10mmol/LdNTPs、50ng/μL引物各1.0μL、4.0μL稀释50倍的预扩增产物及2μL10×PCR Buffer;使用该方法,获得了清晰、稳定的图谱并筛选到了18对多态性较好的AFLP引物组合。 相似文献
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大白菜基因组DNA的提取及AFLP反应体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以大白菜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的大白菜叶片总DNA,通过优化酶切、连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了大白菜AFLP银染反应体系,得到了清晰的大白菜AFLP指纹图谱为大白菜品种的分子标记和大白菜品种间亲缘关系等研究奠定了基础.研究结果表明:(1)DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB提取法可用于大白菜AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹.(2)大白菜基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量150ng,反应体积为12.5μL,EcoR I 1.25 U,Mse I 1.25U,5xReaction Buffer,最佳酶切时间为:37℃酶切4h.连接反应于20℃连接2.5h即达最佳效果.(3)6对引物组合(E-AAC/M-CAG、E-AAG/M-CAC、E-ACA/M-CTG、E-ACT/M-CAC、E-ACT/M-CTT、E-ACT/M-CTC)均获得稳定、清晰的扩增图谱,可进行中国大白菜的遗传变异分析. 相似文献
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甘肃金鳟是我国自主培育的虹鳟新品种,为进行其种质资源研究和遗传管理,以其尾鳍为试验材料,提取基因组DNA,对影响甘肃金鳟扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,包括模板DNA浓度、基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2+、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M+3/E+3配比等进行比较分析,建立了适于甘肃金鳟的AFLP反应体系。即：100 ng 基因组DNA,3 U EcoR I 37℃酶切3 h,再 Mse I 65℃酶切5 h;然后用1 U的T4连接酶连接12 h, 选扩25 μl PCR反应体系中Mg2+2.0 mmol/L,预扩产物稀释30倍,选扩引物M+3/E+3配比为8∶1,所得产物经电泳和银染后可获得清晰条带,效果良好;筛选出了适宜甘肃金鳟品种分析的13对选择性引物。 相似文献
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萝卜抽薹性研究的AFLP体系建立与优化 总被引：1，自引：1，他引：0
摘要：本研究以萝卜‘春雪总太’为优化材料,对AFLP体系的酶切时间,相关酶、Mg2+、dNTPs的用量,模板稀释倍数以及扩增循环数等6个重要影响因素进行摸索和优化,建立了适合萝卜抽薹紧密连锁基因研究的AFLP分子标记体系。结果表明：在20μL酶切体系中,将400ng的样品DNA用各0.2μLEcoR I和MseI 37℃双酶切10min, 65℃灭活10min;向 5μL酶切产物中加入EcoR I接头和MseI接头各0.5μL,用0.5μL的T4连接酶在20μL的体系中22℃连接过夜;向5μL稀释5倍后的连接产物中加入预扩引物各0.6μL,Mg2+1μL,dNTPs1.5μL,Taq酶0.2μL,ddH2O补齐至15μL,预扩增35个循环;取5μL稀释20倍后的预扩增产物,其他成分用量同预扩增相同,用ddH2O补齐至15μL进行选择性扩增。并将此优化体系在秋白、秋青、春白、秋红、水萝卜五种生态型的16份萝卜材料上进行了验证,电泳条带清楚,多态性强。 相似文献
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为了构建一套适合中国独脚金种质资源的AFLP反应体系,本研究以独脚金幼嫩茎叶为材料,对影响AFLP反应体系的酶切连接反应、预扩增和选择性扩增过程中的一些关键因素进行优化,并利用优化的反应体系对AFLP引物进行筛选。结果表明,最佳的酶切反应体系为DNA模板200 ng,MseⅠ/EcoRⅠ用量3 U,总体积20μL,37℃酶切反应时间3 h,72℃灭活20 min;最佳连接反应体系为T4连接酶5 U,16℃连接过夜;最佳预扩增反应体系为dNTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度2 U,总体积25μL;选择性扩增的反应体系为d NTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度1 U,预扩增产物稀释5～10倍,总体积10μL。采用优化的AFLP反应体系,对来自3个不同来源地的独脚金样本进行选择性扩增,100对引物组合均能扩增出清晰、丰富的条带,且在参试样本中均能表现出一定的扩增多态性。本研究筛选出的引物组合可用于后续独脚金种质资源遗传多样性的研究,为独脚金遗传多样性研究、种质资源保存和鉴定提供一定的参考。 相似文献
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《分子植物育种》2016,(1)
对AFLP实验流程中的基因组提取、酶切等关键因素进行优化,建立了芒属植物的AFLP(扩增片段长度多态性)分析体系。本研究分别采用常规CTAB法和改良的CTAB法提取芒属植物基因组DNA,基因组分别用HindⅢ/MseⅠ系统和PstⅠ/MseⅠ系统进行酶切和连接一步反应,连接产物稀释20倍后进行预扩增,预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增。结果显示:采用改良CTAB法提取的DNA质量优于常规CTAB法;采用PstⅠ/MseⅠ系统酶切的DNA多态性高于HindⅢ/MseⅠ系统。采用优化后的AFLP体系分析30份供试芒属植物材料,从64对引物中筛选出8对多态性较好的AFLP选择性扩增引物,多态性比率达到100%,表明优化后的AFLP体系适合于芒属植物的分子标记分析,为芒属植物种质遗传多样性的分子研究奠定了技术基础。 相似文献
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羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为研究羊耳蒜种质资源遗传多样性,建立并初步应用羊耳蒜AFLP反应体系。以羊耳蒜幼嫩叶片为材料,采用常规SDS法提取基因组DNA,通过优化AFLP反应体系中的几个关键因素,建立适合羊耳蒜的AFLP银染反应体系,并利用筛选出的引物组合对羊耳蒜的遗传多样性进行初步研究。经EcoRⅠ和MseⅠ酶组合37℃酶切3 h后可将500 ng基因组DNA完全切开;酶切产物和接头经16℃连接过夜后,用带有1个选择性碱基的预扩引物和带有3个选择性碱基的选扩引物分别进行扩增,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染,能够得到清晰的扩增图谱。3对引物组合对8个羊耳蒜种群共185个体的扩增共得到221条条带,其中多态性条带195条,多态性条带百分率为88.24%。本研究结果表明建立的AFLP反应体系可用于羊耳蒜种质资源遗传多样性研究。 相似文献
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甘薯AFLP分子标记体系建立 总被引：5，自引：0，他引：5
AFLP是目前最常用的几种标记之一。本文以甘薯为材料,通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化,建立了甘薯的AFLP分子标记体系。优化的甘薯AFLP分子标记体系的程序如下:将4μl100ng/μl的甘薯DNA用EcoRⅠ酶、MseⅠ酶各5U进行双酶切,在37℃下酶切3h后再在65℃下酶切3h;然后加入10μl连接混合液在22℃下连接3h后在16℃下连接10h;取连接产物5μl,10μmol/LEcoRⅠ预扩引物和10μmol/LMseⅠ预扩引物各1.5μl,PCR缓冲液25μl,ddH2O17μl进行预扩增;取5μl稀释20倍后的预扩增产物,50ng/μlEcoRⅠ选扩引物和50ng/μlMseⅠ选扩引物各1μl,PCR缓冲液10μl,ddH2O3μl,进行选择性扩增。本研究为甘薯黑斑病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。 相似文献
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本研究以高感、高抗大白菜小黑点病的大白菜叶柄为试材,对影响cDNA-AFLP分析体系的几个关键因素进行分析,建立了适宜大白菜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP图谱。结果表明:试剂盒法提取的NA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest EcoRⅠ和Fast-Digest MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μL的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳;MBI2×PC Master Mixture反应体系满足扩增反应的需要,不需要另外摸索反应条件,节省了试验成本;选用64对AFLP引物进行扩增,筛选出具有多态性条带丰富的AFLP引物45对。本研究为利用cDNA-AFLP分析大白菜小黑点病的的发病机理奠定了基础。 相似文献
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苦瓜外观性状AFLP反应体系的建立及优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为探讨苦瓜性状遗传多样性奠定基础,通过对酶切方法的比较研究,建立并优化了苦瓜AFLP反应体系,采用TaqI/VspI或EcorI/MseI两种限制性内切酶酶切组合对的苦瓜(Momordica charantia.L.)的遗传多样性进行研究,探索适合其AFLP的双酶切体系。结果表明EcorI/MseI内切酶进行双酶切时酶切效果较好并且扩增出的条带带纹清晰,扩增信号强度基本一致符合研究需求,并初步筛选得到了32对清晰、多态性高的AFLP引物。说明最适宜的酶切方法是使用EcorI/MseI组合进行双酶切,通过重复试验证明了该体系稳定可靠,可用于苦瓜性状遗传多样性的分析。 相似文献
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一个白菜型油菜细胞质雄性不育的遗传研究 总被引：2，自引：0，他引：2
１９９３年春在白菜型油菜品种“浠水白”中发现了几株雄性不育株,遗传研究结果表明,“浠水白”雄性不育株为细胞质雄性不育,所有调查过的白菜型油菜品种（系）均具有这种雄性水育的保持系。与ｐｏｌ ＣＭＳ和ｎａｐＣＭＳ的保持系和恢复系的测交结果表明,“浠水白”雄性不育与ｎａｐ ＣＭＳ具有相同的恢保关系,与ｐｏｌ ＣＭＳ具有完全不同的恢保关系。ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＰｓｔⅠ和ＳａｌⅠ四种限制性内切酶的线粒体 相似文献
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山葡萄cDNA-AFLP体系的建立及引物的筛选 总被引：3，自引：0，他引：3
以山葡萄品种左山一的叶片和花芽为材料,对cDNA-AFLP体系的几个关键因素进行摸索,建立了适宜山葡萄的cDNA-AFLP反应体系.结果表明,提取山葡萄的花芽RNA适宜用改良的CTAB法,提取叶片RNA适宜用SDS-酸酚法.在2x Y/T Buffer的作用下,500 ng的cDNA利用Mse Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切4 h即可酶切完全,将16℃连接过夜的产物稀释5倍作为预扩增的模板,预扩增产物稀释20倍作为选扩模板能获得带型稳定可重复性好的结果. 相似文献
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采用了28对EcoR I/Mse I AFLP选择性扩增引物、64对Pst I /Taq I AFLP选择性扩增引物，对作图亲本24-3、B4及其杂种F1进行了分析，统计了两种限制酶组合的扩增总带数、多态性带数及多态性率。秩和检验结果说明，两种限制酶组合AFLP每对引物扩增出的总带数无显著差异，而多态性条带数目以及多态性率均有极显著的差异。证明尝试不同的限制酶组合可望揭示出花生品系材料间更为丰富的遗传变异性。 相似文献
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花生DNA分子标记的研究Ⅲ不同限制酶组合AFLP分析效果比较 总被引：1，自引：0，他引：1
采用了28对EcoR I/Mse I AFLP选择性扩增引物、64对Pst I/Taq I AFLP选择性扩增引物,对 作图亲本24-3、B4及其杂种F1进行了分析,统计了两种限制酶组合的扩增总带数、多态性带数及多 态性率。秩和检验结果说明,两种限制酶组合AFLP每对引物扩增出的总带数无显著差异,而多态性条 带数目以及多态性率均有极显著的差异。证明尝试不同的限制酶组合可望揭示出花生品系材料间更 为丰富的遗传变异性。 相似文献
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为了研究十字花科植物黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc）hrpW基因的功能及Xcc的致病机理,实验以甘蓝型油菜为试验材料,以5~6d无菌苗的带柄子叶为外植体,建立了高效稳定的带柄子叶再生体系,同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素;并用农杆菌介导法将hrpW基因导入甘蓝型油菜中,经PCR检测法分析,证明hrpW基因已整合到油菜基因组中。hrpW基因编码HarpinXcc（十字花科植物黑腐病菌Harpin蛋白）,该转基因植株的获得,为进一步研究十字花科植物黑腐病菌的致病机理提供了材料,也为选育高效抗病油菜种质奠定了基础。 相似文献