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不同细菌电击转化效率各异,为筛选防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6电击转化最佳条件,选取具卡那霉素抗性标记的质粒pBBR-rpoD,从电场强度、电击时间、质粒添加量、电击悬浮溶液和细菌生长阶段5个方面优化电击转化条件.结果表明:当细菌培养至D600nm值1.4左右时,在电场强度为12 kV·cm-1、电击时间为4 ms、质粒添加量为200 ng,并以1 mmol·L-1 HEPES作为电击悬浮溶液时转化效率最高,可达1.1×105转化子?μg-1(DNA).此外,HEPES浓度的改变并未对转化效率产生影响.这一研究建立了一套防御假单胞菌FD6的高效电击转化体系,为今后该菌株在分子水平上的遗传操作提供了重要参考. 相似文献
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为探索大肠杆菌DH5a高效电击转化条件，通过对电击转化条件中细胞生长状态、DNA加入量、感受态细胞体积、电场强度、速冻和恢复时间等关键因素进行优化，筛选出大肠杆菌DH5a高效电击转化条件。结果表明：大肠杆菌在细胞生长状态OD600值为0.6时制备感受态细胞，按每管50μL体积分装、-80℃乙醇速冻后，加入10 pg pUC 19质粒DNA,在20 kv·cm-1电场强度、电容25μF、电阻200Ω条件下电击转化，转化后恢复培养60 min,转化效率达1010 cfu·μg-1 DNA以上水平，可满足基因文库构建、抗体库筛选等试验需求。 相似文献
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从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k 538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达栽体pET -30 a(+)上构建重组表达质粒pETlac 4.将pETlac 4电击转化到大肠杆菌BL 21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3 h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475 U/mL,37℃仅为0.134 U/mL. 相似文献
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利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。 相似文献
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从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达载体pET-30a( )上构建重组表达质粒pETlac4。将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况。表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,k／ac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0、475U／mL,37℃仅为0．134U／mL。 相似文献
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为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。 相似文献
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利用改进的冻融法和电击法成功地将带有编码DREB转录因子GmDREB基因的prdGm-200双元载体分别导入根癌农杆菌EHA101、EHA105和LBA4404菌株中,同时探讨了影响冻融法和电击法转化效率的因素。结果表明:农杆菌细胞OD600约为0.6时冻融法和电击法的转化效率均较高。在利用冻融法转化农杆菌时,新制备的感受态细胞有利于提高转化效率。在进行电击法转化农杆菌时,电场强度和脉冲时间都对农杆菌的转化效率有影响。 相似文献
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【目的】构建一个适于嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）的基因打靶载体，并分析转化四膜虫的特性。【方法】以嗜热四膜虫组蛋白H4-I基因作为启动子，利用H4-I基因的5′和3′侧翼区作为同源臂，并且保留H4-I基因编码区的起始密码子ATG和终止密码子TGA，中间嵌入巴龙霉素抗性标记基因neo，从而构建一个基因打靶载体。将该载体电击转化到嗜热四膜虫接合株体内，使其同源重组到四膜虫H4-I基因上。通过巴龙霉素抗性筛选、PCR扩增目的基因对抗性虫株进行鉴定。光学和电子显微镜观察抗性虫株形态变化。【结果】成功构建了一个适于嗜热四膜虫的基因打靶载体，将其电击转化到四膜虫体内，抗性虫株的生长速度明显高于普通四膜虫，显微镜观察抗性虫株形态变小，大约是正常形态的1/20～1/30，抗性虫株表面光滑，未见纤毛。【结论】利用基因打靶载体将neo基因定向整合到四膜虫H4-Ⅰ基因内部，为今后在嗜热四膜虫体内表达外源蛋白奠定了基础。 相似文献
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[目的]探讨外源DNA导入酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)2.558的电转化条件,初步确立提高其转化效率的方法。[方法]通过调整电转化的参数,将已构建好的转化载体转化至酿酒酵母2.558的感受态细胞中,对影响电转化的主要因素进行研究。[结果]采用对数生长中期菌体制备的感受态细胞,在质粒DNA加入量为1μg、电场强度为1.8 kV/cm、电阻为225Ω、用复苏缓冲液Ⅱ进行复苏培养的条件下,电转化效率达到最大值。[结论]该研究确定了酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)2.558的最优电转化条件,为其遗传改造奠定了良好的技术基础。 相似文献
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枯草芽孢杆菌转换效率低一直制约着该菌基因改造技术的应用,本研究比较了化学法和高渗电转化法对枯草芽孢杆菌转化率的影响,发现高渗电转化法的转化效率较高.从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,构建成重组分泌型表达载体pWB980-Mapr,碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌DB104中得到表达.SDS-PAGE 分析,重组蛋白酶的分子量为 28 000.pWB980-Mapr在枯草芽孢杆菌中表达的酶活为1 563 U/ml. 相似文献
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In this paper, several factors that affect the efficiency of in vitro adventitious bud regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of F. vesca were studied. The results showed that F. vesca seeds germination rate was the highest while seeds were cultured in water, and the germination rate was the lowest while seeds were cultured on MS medium supplemented with hormone; the germination rates that seeds cultured on two and three layers filter paper were higher than that seeds cultured on four and five layers filter paper. In vitro adventitious regeneration efficiency was affected by different explants types. The significant difference was existed between petioles and leaves. When using the same type explants, in vitro adventitious buds regeneration rate and the average number of buds per explant between Ruegen(RE) and Yellow Wonder(YW) had no significant difference. RE to Agrobacterium tumefaciens was more sensitive than YW. Using seedling leaves of RE and YW as materials, an efficient Agrobacterium-mediated transformation system was developed. In this system, the concentration of bacteria was OD_(600)=0.5, the explants were immersed in bacteria broth for 9 min, the co-cultured time was 2 days, and had no pre-cultured time. The percentage of explants with resistant buds of RE and YW was compared. The putative transformed plants were confirmed by PCR. 相似文献
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采用横切薄片培养方法建立了香蕉基因转化的适宜受体系统.结果表明:在30℃、黑暗培养15 d,而后转入24℃、光照培养5 d的条件下,香蕉横切薄片的出芽率较高,植株生长较健壮,适宜用作转基因的受体;羧苄青霉素对香蕉薄片的生长没有明显的抑制作用,可以作为转化的抑菌剂;香蕉对潮霉素比较敏感,能够显著抑制香蕉横切薄片的出芽率,确定用40mg.L-1作为潮霉素的筛选含量. 相似文献
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An assay was developed to detect recombination events taking place in an in vitro reaction. Extracts of cultured mouse preB lymphocytes were found to catalyze homologous recombination between substrate DNA molecules but not site-specific recombination between cloned mouse immunoglobulin D and J genes. Addition of deoxyribonucleoside triphosphates increased the frequency of homologous recombination. This recombination activity was not observed in two differentiated lymphocyte cell lines. 相似文献