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大豆查尔酮异构酶基因的克隆及乳酸菌表达载体的构建（摘要） 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]将特异存在于豆科植物的Ⅱ型查尔酮异构酶基因CHI1A构建到目前最有效的食品级乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中。[方法]利用RT-PCR技术从大豆总RNA中克隆CHI1A基因,连入pMD18-T克隆载体中并进行测序,然后重组到乳酸乳球菌表达载体PNZ8149-CHI1A,利用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ3900中。[结果]克隆得到CHI1A完整开放阅读框670bp,与已报逍的大豆查尔酮异构酶基因的核苷酸序列（GenBank AY595413）的同源性达到99%;通过PCR和酶切鉴定,成功地将CHI1A导入到NICE表达系统中。[结论]含有CHI1A基因的乳酸乳球菌高效诱导表达载体的构建为利用微生物发酵产生类黄酮奠定基础。 相似文献
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乳酸菌NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统,而乳酸菌分泌表达异源蛋白比细胞质表达更优越。本研究将以pVE5524为模板PCR扩增的1.5 kbSPUsp45-NucA-CWAM6-t1t2基因克隆到食品级细胞内诱导表达载体pRNA48上,构建成食品级细胞壁锚定表达载体pRNV48,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定诱导表达系统。为检测该系统的功能,将铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H克隆进pRNV48中,并检测了OprF/H的表达量和免疫原性。 相似文献
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利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相... 相似文献
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猪链球菌（Streptococcus suis,SS）烈性噬菌体SMP的宿主谱窄,制约了其临床应用潜力。研究发现,由噬菌体编码的裂解酶（LySMP）可有效拓宽其裂解谱。本研究以SMP基因组DNA为模板,扩增获得SMP裂解酶基因,将其克隆至质粒pNZ8148中,电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得重组乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148-LySMP）,经Nisin诱导可表达LySMP。浊度递减实验结果显示,所表达的LySMP对7株猪链球菌2型菌株和猪链球菌9型菌株有较高的裂解活性,浊度下降可达30%~77%。表明利用NICE表达系统及pNZ8148表达载体在乳酸乳球菌中可实现猪链球菌噬菌体裂解酶的活性表达,为开展LySMP的应用研究提供了可能。 相似文献
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[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。 相似文献
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利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。 相似文献
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[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究. 相似文献
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[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。 相似文献
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将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(... 相似文献
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[目的]为构建盐穗木盐响应基因HcALDH7A1的原核表达载体并进行外源基因的诱导表达和优化.[方法]以实验室已构建好的p mD18-T Simple-HcALDH7A1/DH5α(Pst Ⅰ,SacⅠ)重组载体中盐穗木醛脱氢酶基因(HcALDH7A1)为模板,设计带有酶切位点(EcoRⅠ,XhoⅠ)的引物通过PCR扩增亚克隆到p mD18-TSimple vector中,测序鉴定正确后,通过EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切,构建重组的原核表达载体pET28a-HcALDH7 A1.将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达,并对其表达体系进行优化.[结果]成功构建盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1的原核表达载体,诱导HcALDH7A1外源基因表达蛋白优化的最佳条件为IPTG终浓度为0.6 mmol/L,30℃诱导时间为4h.融合蛋白分子量大小为61 kD.[结论]成功在大肠杆菌体内诱导表达盐穗木醛脱氢酶HcALDH7A1基因,并明确目的蛋白的最佳表达条件.为后续在原核表达系统大肠杆菌细胞中探索盐穗木HcALDH7A1的生物和非生物胁迫的功能奠定了基础. 相似文献
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【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 相似文献
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[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原 相似文献
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《江苏农业学报》2014,(1)
为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pLEB590-SQR的构建及其在乳酸乳球菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切载体pLEB590与目的片段SQR,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过电转化法转化到乳酸菌中,提取所得到的乳酸乳球菌质粒pLEB590-SQR进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸乳球菌MG1363中,在含有Nisin(乳酸链球菌素)的选择培养基中筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE电泳和Western杂交检测SQR蛋白质的表达情况。最后检测重组质粒在MG1363中的遗传稳定性。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pLEB590-SQR构建成功,从MG1363中成功检测到目的蛋白质SQR的表达,携带pLEB590-SQR的MG1363遗传稳定性达90%以上。乳酸乳球菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。 相似文献
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[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR. 相似文献