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[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。 相似文献
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[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。 相似文献
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应用戊二醛醛化的人的“O”型红细胞纯化兔出血症病毒(RHDV),对非免兔进行3次免疫后,经分段表达的重组杆状病毒、纯化的病毒、Con A分别刺激后进行细胞增殖检测、IL-2、IL-4、IFN-γ检测.WST检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,所有重组杆状病毒与空白对照组差异显著；IL-2和IFN-γ检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,其次为2号、4号,而1号、5号重组杆状病毒刺激指数较低,但均高于对照组；IL-4检测结果表明,2号、3号、4号重组杆状病毒刺激的值低于对照组,1号、5号重组杆状病毒刺激组略低于对照组.研究结果表明,重组病毒3号区域为RHDV VP60 T细胞表位的优势区,从而为后期的试验奠定了基础. 相似文献
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表达并纯化M6型GAS表面三磷酸甘油醛脱氢酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。克隆了M6型GAS ATCC32175的GAPDH基因以及GAPDHΔ345基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;对重组蛋白进行质谱检测,并用酶切方法进一步纯化目的蛋白,通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,酶切后纯度高,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。功表达并纯化了rGAPDH和rGAPDHΔ345蛋白。 相似文献
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《江苏农业学报》2016,(5)
本研究旨在探讨重组猪TREM-1基因CDR区蛋白对猪肺泡巨噬细胞受到脂多糖(LPS)刺激后炎症因子表达状态的改变。首先克隆猪TREM-1基因CDR区,然后构建重组载体并转入BL21(DE3)中,IPTG诱导表达、纯化并复性猪TREM-1基因CDR蛋白。将不同浓度复性的重组蛋白添加到1 000 ng/ml LPS处理的猪肺泡巨噬细胞培养液中,然后通过荧光定量PCR方法分别测定主要促炎症因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18及TNFα)的表达规律。结果显示,重组猪TREM-1CDR区蛋白可显著降低由LPS诱导的主要促炎症因子的表达。表明重组猪TREM-1基因CDR区蛋白具有抑制炎症反应的生物学活性。 相似文献
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[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。 相似文献
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SDS-PAGE电泳分析显示,经过不同浓度梯度的IPTG诱导,获得了带有重组质粒pET32a-c(+)/HmH-SP70的大肠杆菌产生可溶性重组蛋白的最佳诱导条件。当IPTG的终浓度为0.15mmol/L时,诱导可溶性重组蛋白的量最高,重组蛋白浓度为22.5mg/ml。同时SDS-PAGE显示得到蛋白分子量约为90KDa的融合蛋白。并对诱导过程中产生的包涵体进行了变性和透析复性,使其变为可溶性蛋白;通过镍亲和层析的纯化以及肠激酶的酶切作用,最终得到纯度较高的HmHSP70,纯化后的目的蛋白分子质量约为70KDa,与预期结果吻合。 相似文献
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为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni~(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。 相似文献
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重组鲤鱼生长激素的试验制备与纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
采用高效表达鲤鱼生长激素的大肠杆菌基因工程菌株E .coli(pBVcGH8)进行发酵培养 ,经温度诱导可产生一分子量约为 3.6 3× 10 -2 0 g的特异表达产物 ,该表达产物主要以包涵体的形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 2 9.2 %。表达产物经包涵体收集、洗涤等初步纯化后 ,纯度可达 85 .0 %。再经变性与复性后 ,用阴离子交换层析进一步分离纯化 ,最终可获得纯度为 96 .0 %的重组鲤鱼生长激素。用该纯化过的重组鲤鱼生长激素注射罗非鱼 ,有明显的促生长作用 相似文献
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【目的】解析大豆重组自交系中百粒重的QTL及其等位变异效应,探究重组自交系中百粒重存在超亲分离的原因,为进一步培育不同类型百粒重大豆提供遗传依据。【方法】利用以先进2号和赶泰2-2为亲本衍生的重组自交系群体NJRSXG为材料,在2009-2011年共5种环境下测定百粒重表型数据,建立具有400个SSR标记的遗传图谱,选用QTLNetwork V2.1软件中混合模型区间作图方法（mixed model based composite interval mapping,MCIM）对表型数据和基因型数据进行大豆百粒重QTL定位研究。在定位结果基础上,分析每个重组自交系群体中每个家系百粒重QTL等位变异类型,建立百粒重QTL-allele矩阵。【结果】5种环境试验的平均结果,亲本先进2号和赶泰2-2的百粒重分别为16.92和14.14g,重组自交系百粒重变幅为12.09-25.01 g,存在超亲分离,多环境下遗传变异系数（genotypic coefficient of variation, GCV）为16.06%,遗传率为96.17%。利用MCIM方法联合5环境原始数据,总共检测到10个加性QTL和9对上位性QTL,10个加性QTL的表型变异解释率变幅为0.69%-14.93%,其中Sw-05-2、Sw-08-1、Sw-12-1和Sw-17-1的表型变异解释率较高,分别为6.91%、14.93%、7.80%和5.01%,Sw-13-3为以往未见报道并兼具加性和上位性效应的位点。上位性QTL的表型变异解释率较小,变幅为0.31%-3.44%,其中Sw-e4的表型变异解释率最高。联合多环境方差分析和QTL定位结果,解析大豆百粒重的遗传结构,发现加性QTL累积贡献了47.91%表型变异,上位性QTL累积贡献13.06%表型变异,未检测出的微效QTL累计解释了35.20%的表型变异。在定位的同时,获得了QTL等位变异的效应,分析重组自交系及其亲本中百粒重QTL等位变异的组成,建立了NJRSXG的百粒重QTL-allele矩阵;两亲本分别具有7对和3对加性增效等位变异,属互补型组合;矩阵中没有一个重组自交家系包含所有减效等位变异或增效等位变异,表明重组自交家系具有进一步改良的潜力;大粒型家系具有较多增效等位变异,小粒型家系具有较多减效等位变异;说明百粒重位点间的重组是产生超亲家系的重要原因。【结论】利用重组自交系群体能够产生超亲分离家系;联合多环境数据检测到10个加性QTL和9对上位性QTL;百粒重QTL位点间的重组是超亲分离的原因;重组自交家系间具有进一步重组的潜力。 相似文献
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大豆百粒重QTL定位及多样性评价 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】百粒重是大豆重要的育种目标性状,它不仅是产量构成因子之一,也是重要的品质性状,不同用途对百粒重有着不同要求。通过连锁分析定位大豆百粒重QTL,获得连锁标记,阐明QTL连锁标记在种质资源中的多样性特征,为百粒重定向改良提供依据。【方法】以冀豆12×黑豆（ZDD03651）杂交衍生的188个重组自交系的F6:8和F6:9群体为材料,采用WinQTL Cartographer V. 2.5的复合区间作图法（CIM）,经300次Permutation 计算,以P=0.05显著性水平确定QTL存在的阈值,定位百粒重QTL。连续3年在石家庄对来自国内外的205份大豆育成和地方品种的百粒重进行表型鉴定,利用定位到的百粒重QTL连锁SSR标记对种质资源材料进行基因型分型,在每个标记处确定发生频率大于5%（对应资源材料个数大于10个）的等位变异为有效等位变异,计算等位基因多样性指数,明确百粒重QTL在种质资源里的多样性特征,通过多重比较确定不同等位变异与百粒重的关系。【结果】在冀豆12×黑豆后代群体中,百粒重呈正态连续分布,遗传力为88.72%。共检测到5个百粒重QTL,分别位于Chr.02（D1b）、Chr.06（C2）、Chr.08（A2）和Chr.17（D2）染色体,遗传贡献率（R2）7.68%-12.83%,加性效应-0.65--0.84 g,增效基因均来自冀豆12。年份间稳定的QTL有2个,其中,qSW-6-1位于第6染色体Satt457-Sat_062,紧密连锁的标记为Satt281,贡献率最大值为12.02%,加性效应最大值为-0.81g;qSW-17-1位于第17染色体Satt301-Satt310,贡献率最大值为12.83%,加性效应最大值为-0.84g。在205份资源材料中,百粒重遗传力为96.88%。百粒重连锁SSR标记有效等位变异数为2-8个,多样性指数为0.34-0.82。发掘出大粒相关等位变异6个,分别为Satt281-227 bp、Barcsoyssr_2_304-245 bp、Satt301-199 bp、Sat_406-214 bp、Satt119-136 bp和Satt341-218 bp。其中Satt281-227 bp在RIL和资源材料中均为百粒重增效效应,主要分布在国内大粒育成品种中。筛选到含有4个及以上大粒相关等位变异的资源材料3份,分别为绿75、中品大黑豆和中野2号。【结论】在大豆育成品种冀豆12×地方品种黑豆的杂交后代群体中,检测到5个百粒重QTL,冀豆12含有1个在RIL和种质资源中均为大粒相关的优异等位变异。明确了上述5个QTL在205份育成品种和地方品种间的多样性分布特征,可应用于百粒重定向改良过程中的亲本选配及后代选择。 相似文献
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生育酚具有抗氧化、防止人体动脉硬化和心血管疾病等多种功效,在大豆籽粒中含量丰富,但有关其遗传位点与基因发掘工作开展甚少.鉴于此,利用大豆重组自交系群体,通过高效液相色谱鉴定其籽粒生育酚,结合群体SNP连锁图谱与转录组数据,发掘其遗传位点并筛选候选基因.结果 表明,供试群体籽粒生育酚存在较大遗传变异,α-、γ-、δ-生育... 相似文献
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【目的】水稻粒型是与产量直接相关的重要农艺性状,影响稻米的外观品质和商品价值。挖掘新的水稻粒型相关基因,对揭示水稻粒型调控的遗传机理研究有重要意义,同时可为水稻粒型分子育种提供新的基因资源。【方法】以极端粒型差异的粳稻TD70和籼稻Kasalath,以及杂交构建的186个家系的重组自交系群体为研究材料,利用高通量测序技术对亲本和RIL株系进行深度测序。统计186个RIL基因型数据,利用滑动窗法（SNP/InDel数目为15）,将窗口内SNP/InDel信息转换成窗口的基因型,预测染色体上的重组断点构建RIL群体的BinMap遗传图谱,结合2年的粒长、粒宽、粒厚和千粒重的表型数据,运用QTL IciMapping软件,采用复合区间作图法对RIL群体的4个性状进行QTL定位。【结果】构建了一张包含12 328个Bin标记的高密度遗传图谱,该图谱各染色体Bin标记数为763—1 367个,标记间平均物理距离为30.26 kb。粒长、粒宽、粒厚和千粒重4个性状在RIL群体中呈近正态连续分布,且2年间的变化趋势相似,符合QTL作图要求。2018年对粒长、粒宽、粒厚及千粒重进行QTL分析,共检测到40个粒型QTL,其中,粒长12个,粒宽9个,粒厚8个,千粒重11个,2019年对粒长、粒宽、粒厚及千粒重进行QTL分析,检测到56个籽粒相关的QTL,粒长15个,粒宽11个,粒厚13个,千粒重17个。分析定位到的96个粒型QTL位点,连续2年都能检测到的QTL位点有11个,其中7个为已克隆的粒型基因位点,4个为未知的新位点,分别分布于第1、3、4、5染色体上,分别为粒长qGL-1-2和qGL5-2、粒厚qGT-3-2、粒宽qGW-4-1。【结论】构建了一张包含12 328个Bin标记的分子遗传连锁图谱,解析大粒粳稻资源的粒型基因,获得了qGW-4-1、qGL5-2、qGT-3-2、qGL-1-2等4个新的粒型QTL,可用于后续粒型调控基因的精细定位及克隆研究。 相似文献
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[目的]探索高粱总DNA的快速、高效提取方法,为将其导入水稻提供大量、高质量的DNA。[方法]以高粱幼叶为材料,分别采用SDS法、CTAB法、尿素法和NaOH法提取高粱总DNA,并对不同方法提取DNA的纯度、浓度和产量进行检测。[结果]尿素法提取DNA纯度和质量最好,SDS法和CTAB法次之,NaOH法最差。采用尿素法、SDS法、CTAB法和NaOH法分别可从1g高粱样品中提取到约292.00、21.75、152.25和243.75μg的DNA。4种方法提取的高粱总DNA的琼脂糖凝胶电泳结果表明NaOH法不能有效提取高粱总DNA,其他3种方法在提取高粱总DNA时能较好地保证其完整性。高粱总DNA分子量约为50KB。[结论]尿素法提取DNA的纯度最好、产率最高,是一种理想的高粱总DNA提取方法。 相似文献
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山葡萄总RNA提取方法的比较 总被引：1，自引：0，他引：1
以山葡萄成熟果皮及叶片为材料,对改良CTAB法,SDS法和Trizol法3种不同的总RNA提取方法进行了比较。结果表明,SDS法和Trizol法提取的总RNA均有拖带现象,有部分降解,Trizol法提取的总RNA中有DNA的污染;改良CTAB法提取山葡萄叶片和果皮的总RNA带形完整,28SrRNA和18SrRNA的荧光亮度接近2：1,A260／280值为1．8～2．0,该方法提取的总RNA纯度和提取量最高,提取出的总RNA可用于进行RT-PCR、构建cDNA文库等分子生物学的研究。 相似文献
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醋酸铵法提取卵形鲳鲹基因组DNA 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了一种简便、安全、经济的提取卵形鲳鲹基因组DNA的方法,即醋酸铵法。该方法采用7.5mol·L~(-1)醋酸铵代替酚、氯仿,通过高盐-SDS去除蛋白和多糖,异丙醇在一定浓度醋酸铵存在条件下选择性沉淀DNA,而不沉淀蛋白,并通过酶切和AFLP验证该法抽提的DNA纯度。该法提取的DNA质量较高,无蛋白质和RNA污染,较酚/氯仿法和试剂盒法抽提得到量多,酶切和AFLP试验结果表明,提取的DNA可用于酶切分析和分子标记等试验。此法安全、简便、经济,该方法更适合于对大量样品的提取。 相似文献
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[目的]对芥菜型油菜重组自交系群体种子的油含量和蛋白质含量进行检测并分析二者间的相关性,筛选优异育种资源,为芥菜型油菜育种提供研究基础和应用材料.[方法]利用近红外方法测定139份芥菜型油菜重组自交系群体种子的油含量和蛋白质含量,并分析两者间的相关性.[结果]在贵阳的环境条件下,139份芥菜型油菜重组自交系群体种子的油含量和蛋白质含量表现出明显的变异,其变异范围分别为33.1%~47.7%和22.0%~33.3%,并被划分为三大群体.群体Ⅰ材料的油含量和蛋白质含量平均值分别为33.7%和32.8%,变异系数分别为2.3%和0.7%;群体Ⅱ材料的油含量和蛋白质含量平均值分别为41.2%和26.2%,变异系数分别为5.3%和6.6%;群体Ⅲ材料的油含量和蛋白质含量平均值分别为45.9%和23.6%,变异系数分别为2.7%和4.8%.相关性分析结果显示,芥菜型油菜种子的油含量和蛋白质含量呈极显著负相关(P<0.01).[结论]芥菜型油菜重组自交系群体种子的油含量和蛋白质含量变异丰富且存在显著负相关.高油含量株系RIL020、高蛋白质含量株系RIL038和高总含量(油+蛋白质)株系RIL078是3份优异的芥菜型油菜种质资源,可用于芥菜型油菜的遗传育种和基础研究. 相似文献