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1.
采用正交试验设计L_(16)(4~5)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg~(2+)、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板rTaq酶Mg~(2+)引物dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg~(2+) 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。 相似文献
2.
桑树SSR-PCR反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立经济稳定的桑树简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础,采用L_(16)(4~5)正交试验设计和单因素试验,对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析,并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg~(2+)、dNTPs引物模板DNArTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含有1.5μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4μL 25 mmol/L Mg~(2+)、0.5μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15μL 20μmol/L正反向引物、0.1μL 5 U/μL rTaq酶和1μL 10×loading buffer。通过稳定性检测,表明该体系能够用于桑树的SSR分析。 相似文献
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《江苏农业科学》2015,(11)
利用已报道的i PBS引物2249和3个杨梅品种的DNA为模板进行i PBS-PCR扩增,采用单因素法对杨梅i PBS-PCR反应体系的4个组分(d NTP、Mg~(2+)、引物、模板)用量进行优化,确定了杨梅i PBS-PCR 20μL反应体系:2μL 10×Taq buffer,1.6μL 25 mmol/L Mg~(2+),1.6μL 2.5 mmol/L d NTP,1μL 10μmol/L引物,0.2μL 5 U/μL Taq酶,30 ng模板DNA。梯度PCR试验表明可以参考i PBS引物Tm值确定退火温度。利用上述体系对随机取样的10个品种用4条i PBS引物进行扩增,得到了条带清晰、多态性好的i PBS谱带。 相似文献
4.
为建立适合绿绒蒿属(Meconopsis Vig.)的SSR反应体系,以多刺绿绒蒿(M.horridula)为试材,应用L_(25)(5~6)进行正交试验,对影响SSR-PCR的主要因素进行优化。结果发现,Mg~(2+)对PCR反应效果影响最大,而dNTPs的影响最小。5个因素水平的变化对绿绒蒿属SSR-PCR反应体系的影响从大到小依次为Mg~(2+)Taq酶含量引物浓度DNA模板量dNTPs浓度。适宜绿绒蒿属的SSR反应体系:总体积25μL,Mg~(2+)浓度2 mmol/L,dNTPs浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.5μmol/L,DNA模板量60 ng,Taq聚合酶量1.6 U,其余用ddH_2O补充。扩增程序为94℃1.5 min;94℃20 s,最适退火温度20 s,72℃1 min,共35个循环;72℃5 min;4℃保存。利用优化后的反应体系对同属另外8种绿绒蒿(M.wallichi、M.racemosa、M.lingholm、M.prattii、M.rudis、M.napaulensis Pinky、M.paniculata、M.superba)进行PCR扩增,均获得优良的扩增产物。因此,该试验建立的反应体系适用于绿绒蒿属植物的SSR-PCR反应。 相似文献
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《江苏农业科学》2017,(16)
利用梭罗草(Kengyilia thoroldiana)基因组DNA优化并建立的梭罗草扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。预扩增反应体系25μL:连接产物1μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.375μL,Mg~(2+)1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,EcoRⅠ预扩引物1μL,MseⅠ预扩引物1.2μL,dd H2O加至25μL;选扩增反应体系25μL:预扩产物(稀释20倍)2.0μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.60μL,Mg~(2+)2μL,Taq DNA聚合酶0.1μL,EcoRⅠ选扩引物1.5μL,Mse I选扩引物2.5μL,dd H2O加至25μL。利用优化后的AFLP体系,从梭罗草、大颖草(K.grandiglumis)、疏花以礼草(K.laxiflora)共10份供试材料中筛选出216对选择性扩增引物,从中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰、鉴别效率高的引物,其中E16C4、E4C10的扩增条带中均有梭罗草的特征条带,为梭罗草的种质鉴定及利用提供科学依据。 相似文献
6.
[目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度)进行L_(16)(4~5)正交试验设计,并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系:Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 U、引物0.25μmol/L、模板DNA 20 ng,共10μL。反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,引物退火温度30 s,72℃30 s,30个循环;72℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体,为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。 相似文献
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为建立并优化大叶石上莲(Oreocharis benthamii)ISSR-PCR反应体系,采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA,利用正交试验设计方法,从Mg~(2+)、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平,对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系:2.0μL的10×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTP,0.7μmol/L引物,2.0 U TaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板(20μL反应体系)。在此基础上,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。 相似文献
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由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase (5 U/μL) 1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH20 7.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA... 相似文献
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草莓RAPD反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以草莓幼叶为试材,进行RAPD反应扩增体系的优化.对模板、dNTP、引物、MgCl2和Taq DNA聚合酶等条件进行优化.结果表明,在20 μL的反应体系中,以DNA模板用量25 ng,引物用量为0.15 μmol·L-1,dNTP用量为120μmol·L-1,Mg2+用量为2.5 mmol·L-1,Tap DNA聚合... 相似文献
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多花黄精ISSR反应体系的建立及正交优化设计 总被引：1，自引：1，他引：0
通过对多花黄精ISSR-PCR反应中的Taq酶、buffer(Mg2+)、模板DNA、dNTP以及引物5个关键因素进行了5因素4水平的正交设计试验,确立了适合多花黄精基因组DNA的稳定性强、扩增最多数量谱带的ISSR-PCR最优反应体系,即25μL的反应体系中含有1.0 U Taq DNA聚合酶,3.5 mmol.L-1buffer(Mg2+),80 ng模板DNA,0.08 mmol.L-1dNTP和0.16μmol.L-1引物。采用建立的多花黄精ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯度试验,确定了引物UBC841的最适退火温度为54.8℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行黄精种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了良好的技术基础。 相似文献
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采用改良CTAB法提取葡萄属22种植物的基因组DNA,对其完整性进行了测定,通过单因素五水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了葡萄RAPD技术最优体系,即25 μL体积中模板DNA为40 ng·μL-1,MgCl２ 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.8 mmol·L-1,Taq DNA 聚合酶1 U·μL-1,引物 0.8 μmol·L-1,建立了葡萄基因组DNA的RAPD 反应扩增程序,即94℃预变性4 min, 94℃循环变性 45 s,37℃退火 55 s,72℃ 延伸 80 s,40个循环,最后72℃ 延伸10 min。 相似文献
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为获得稳定的聚合酶链式反应（PCR）产物,采用正交设计L25（56）对光皮桦Betula luminifera表达序列标签一简单重复序列聚合酶链式反应（EST-SSR PCR）反应体系中的5个因素：DNA模板浓度,引物浓度,镁离子（Mg2＋）浓度．三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明：光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系：4．0mg·L-1DNA模板,0．500μmol·L-1引物,1．250mmol·L-1Mg2＋,0．250mm01·L-1dNTPs．0．0725×16．67mkat·L-1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST—SSRPCR反应体系进行稳定性检测．结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15 相似文献
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以三球悬铃木组培苗为试验材料,对影响SSR-PCR扩增效果的退火温度、dNTP、引物浓度、Taq酶量及悬铃木DNA等因素的筛选,建立适宜的悬铃木SSR-PCR分子标记反应体系。结果表明,在20μL-1体积中,50℃退火温度、4 ng.μL-1模板DNA、0.2 mmol.L-1 dNTP、0.05 U.μL-1 Taq酶量和0.6μmol.L-1引物浓度是悬铃木的最适SSR反应体系。此外,利用该体系筛选出了54对适合悬铃木SSR扩增的引物。 相似文献
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一串红SRAP标记的建立与品种鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立一串红相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记,对引物、dNTP、模板DNA、Taq酶用量及退火温度等因素进行了优化,并用建立的SRAP标记对17个一串红品种进行了鉴定。通过测试,确定了适宜一串红的SRAP-PCR反应体系,反应总体积25 μL,包含PCR缓冲液(含2.0 mmol·L-1 MgCl2),模板DNA 60 ng, dNTP 0.2 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq酶1 U。温度梯度试验结果表明,SRAP-PCR对第二阶段的退火温度变化(44～56℃)不敏感。在优化SRAP-PCR体系的基础上,采用44对引物组合对17个一串红品种进行了分析。共筛选到37个多态性引物组合。这些引物组合的多态性信息含量(PIC)为0.215～0.941,平均为0.672;所揭示的基因型数为2～17个, 平均为6.76个。仅用F1/R1这一个引物组合就可以鉴别参试的17个品种,包括形态上非常相近的品种‘神州红’和‘帝王’,表明SRAP对一串红品种具有较强的鉴别能力。 相似文献
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三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌 总被引：5，自引：1，他引：5
【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。 相似文献
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以三华李品系中的白脆鸡麻李1为供试材料,利用分步优化法对影响SRAP-PCR反应的5个因子进行优化,确立了三华李的SRAP-PCR反应体系：模板DNA 15 ng,Mg2+浓度3.0 mmol·L-1,引物浓度0.25 μmol·L-1,dNTPs 0.3 mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,10×Buffer 2.5 μL,反应总体积为25 μL,其余部分用ddH2O补充。利用优化的体系对18份李属种质资源进行扩增,经6%聚丙烯酰胺凝胶检测显示：条带清晰可靠、多态性好,可用于三华李的分子标记研究。 相似文献
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正交设计优化茄子SSR反应体系 总被引：2，自引：0，他引：2
以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。 相似文献