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烟草的N基因是一个较为有效的抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)基因,在抗病育种中发挥着重要的作用。为建立其标记基因PCR检测体系,评估已知目的基因cDNA序列作为分子标记的目的基因辅助育种的可行性,本文依据N基因cDNA序列设计4对扩增范围在150～950bp的不同片段长度引物,并对含有N基因的coker176基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果表明,有3对可扩增出特异产物。测序结果表明,有2对引物的扩增产物含有内含子。根据所获得的DNA序列设计出2对用于分子标记辅助育种的引物,并分别对C151、NC89、coker176等11个品种的基因组DNA进行扩增,结果表明在coker176、龙江912、吉烟9号和龙江911品种中有扩增产物,除龙江911外,这一结果与已知的N基因在11个品种的分布相一致,成功建立了N基因PCR检测体系,并证明以cDNA序列设计引物扩增DNA序列的目的基因辅助育种技术完全可行。并对实验中出现的问题进行了研究。 相似文献
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1995年由LIU[1~3]等首创并发展了热不对称交错PCR（TAIL-PCR, Thermal Asymmetric Interlace PCR）方法,对拟南芥中T-DNA整合位点的侧翼序列进行了扩增。这种方法利用3个特异的巢式引物和1个较短的随机简并引物引发PCR扩增。它用一系列特异性的巢式引物除去由特异引物单独延伸所产生的非特异性产物。又由于特异性引物和随机引物的退火温度有明显的差别,所以用特殊的热循环程序使PCR反应有利于特异性产物的扩增,而抑制由随机引物产生的非特异性产物。 相似文献
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烟草普通花叶病,由烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)引起,是烟草生产中的常见病害之一,培育和种植抗病品种是解决该病害的主要途径,育种材料的抗性鉴定是抗病育种的关键环节。为提高TMV抗性鉴定效率,本研究根据TMV与N基因作用的原理设计了一种烟草苗期离体接种快速鉴定TMV抗性的方法。该方法为研磨病害严重程度为5级的新鲜病叶(10 g)并过滤,往过滤液中加纯净水(100 m L)稀释为病毒液;摘取6～7叶期烟苗的叶片(从上往下数第3叶)进行离体摩擦接种;3 d后观察坏死斑发生情况。应用此鉴定方法对20份烟草材料的TMV抗性进行鉴定,结果表明13份材料出现免疫斑;同时,对20份烟草材料的N基因进行了检测,结果表明13份材料含有N基因。出现免疫斑的材料与含N基因的材料相一致,证明了苗期离体接种方法鉴定TMV抗性的可行性。将此方法应用于21 524份育种中间材料(7 047株BC1F3、10 013株BC1F4、4 464株BC1F5)的... 相似文献
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<正>福建省农业科学院植物保护研究所发明的一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法近期获得国家专利。该发明主要设计了一对烟草疫霉菌的特异引物(上游引物YhF:5'-GACATGATATCAACTGTTCTGCAG-3'和下游引物YhR:5'-CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG-3'),经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,可在烟草疫霉菌纯DNA、带菌的发 相似文献
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为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×101 copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。 相似文献
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构建重组表达载体pBIb-CG(含有Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因),利用农杆菌介导法将其携带的Chi-linke1r-Glu融合基因和Bar基因转化烟草(Nicotiana tobaccum L.)品种红花大金子.经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg/L Kar+500mg/L Cef筛选抗性芽,获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％;分别对抗性再生植株中Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％.PCR、Southern杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中.离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌(Tricho derma viride)、镰刀菌(Fusarium solanif sppisii)和除草剂都表现出一定的抗性. 相似文献
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利用多重PCR技术同时检测6种棉花转化体的方法研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】建立1种转基因棉花多重聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】试验选择6种转基因棉花作为多重PCR检测对象,通过引物终浓度配比和引物退火温度的两要素全组合优化多重PCR反应体系,并分析方法灵敏度。【结果】多重PCR较优的MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531引物终浓度为0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20μmol·L-1,较优引物退火温度为56℃,方法灵敏度为66个拷贝棉花基因组。利用盲样对上述体系的验证结果显示,所有盲样扩增条带与其含有的转基因转化体完全一致。【结论】本研究建立的体系可用于6种棉花转化体的快速检测。 相似文献
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小麦白粉病是严重影响小麦生产的病害,培育抗病品种是防治小麦白粉病的最经济、有效的方法。为了探索白粉病广抗基因快速有效筛选及利用的新方法,根据MLO蛋白的跨膜保守结构域设计兼并引物,以24个抗性不同的小麦材料的基因组DNA为模板通过PCR扩增进行研究。结果表明:本研究设计的兼并引物扩增效率可以达到95.8%(23/24),除5号材料外其余的小麦材料都能扩增出多条DNA片段。本研究所设计的兼并引物扩增效率高,但由于扩增条带不唯一,需要进一步优化扩增条件减少非特异扩增,为下游转化、克隆及进一步筛选广抗基因奠定良好基础。 相似文献
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《种子》2021,(8)
烟草普通花叶病(TMV)是烟区的主要病害之一,生产上所用抗源都来自烟属的心叶烟(Nicotiana glutinosa),其携带N基因对TMV免疫,但因连锁累赘导致烟叶品质差,难以在生产上大面积使用。因此,从烟属植物中挖掘新的TMV抗源尤为必要。本研究以烤烟品种红花大金元与野生种圆锥烟草(N.paniculata,PI 555550)为亲本,开展远缘杂交,获得了种间杂种。杂交种SSR、GISH及抗病性鉴定结果表明,杂交种含双亲特征条带,接种TMV后,叶片有枯斑反应。N基因特异引物在圆锥烟草及杂交种中未能扩增,而根据N基因同源基因Np片段设计的特异引物扩增到500 bp的片段,携带N基因的RBST及心叶烟草(N.glutinosa PI 555507)中未扩增到此特异片段,在杂交种扩增到此特异片段。该研究为获得新的TMV抗源奠定了材料基础。 相似文献
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基于四引物扩增受阻突变体系PCR快速鉴定水稻 S5基因的籼粳属性 总被引：1，自引：1，他引：0
四引物扩增受阻突变体系PCR是一种快速简便检测SNP的方法。基于该技术原理,结合籼型S5i与粳型S5j基因存在的单核苷酸差异设计特异性引物,并用8个籼稻,8个粳稻及4个籼粳杂交后代F1进行PCR扩增检测验证。依据产物的电泳谱带类型,能准确区分出SSi纯合基因型、SSj纯合基因型及杂合基因型3种类型,其扩增带型与基因型完全吻合。这表明所设计引物能很好地对S5基因的籼粳属性进行区分,可广泛应用于水稻种质资源相应目的基因的鉴定,为籼粳杂种优势利用的亲本有效选择和籼粳分化研究提供重要参考。 相似文献
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根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。 相似文献
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通过一次3'端高效热不对称交互PCR（hiTAIL-PCR）和一次长链PCR扩增方法获得了转抗草甘膦基因（G2-EPSPS）玉米品系D-3的外源DNA插入片段的全DNA序列（T-DNA）及两端侧翼序列,并建立了转化体特异性PCR检测方法。结果显示：T-DNA插入片段全长4 318bp,由一个G2-EPSPS基因的表达盒构成。根据T-DNA 5'、3'端侧翼序列设计引物,建立了转化体特异性检测方法,并分析了该方法的灵敏度以及检出限,研究结果表明,3'端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,检出极限为每100ng模板量的0.05%。本研究结果对转抗草甘膦外源基因检测和生物安全评价及监管具有重要意义。 相似文献
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转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测 总被引：3，自引：1，他引：2
采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。 相似文献
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结核杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板的检出下限为1 ×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍。表明建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于结核杆菌CFP10的病原检测及定量分析。 相似文献
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转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转mCry1Ab和mCry2Ab基因的抗虫玉米,本研究的目的是建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。根据研发者提供的引物进行PCR扩增,PCR产物测序分析,获得了5’端旁侧序列262 bp,包括109 bp的载体序列和153 bp的玉米基因组序列, 3’端旁侧序列316 bp,包括76 bp的载体序列和240bp的玉米基因组序列。针对两端旁侧序列设计14条引物,组成25对引物组合进行引物筛选,选中3’端一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法, PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。国内8家转基因生物安全检测机构对本方法进行了特异性测试、检出限测试和再现性测试,循环验证报告显示:该方法符合国家标准方法的各项要求,可在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,为我国ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑。 相似文献
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LEAFY基因在植物成花过程中具有重要的作用.DFL是甘菊中LFY同源基因.本研究将DFL基因导入烟草中,鉴定该基因的功能作用.对经潮霉素筛选的抗性植株进行了组织化学染色、PCR扩增及Southern杂交检测.结果检测出8株为GUS阳性植株,进一步用PCR方法验证出其中6株为PCR阳性植株:Southern杂交检测最终证实有3株烟草植株的基因组中已经整合进DFL基因.对转基因植株的开花期和植物学性状进行观测,并与非转基因烟草植株做对比,结果发现:转DFL基因烟草植株的花期有所改变,其中3株转基因植株花期提前15～23 d;部分烟草植株发生形态学性状的变异,如叶片褶皱,叶色发黄.本研究可为转基因改良花卉品种开花期提供参考. 相似文献