共查询到10条相似文献，搜索用时 234 毫秒
1.
【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。 相似文献
2.
奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白. 相似文献
3.
【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4h,诱导时菌体A600为0.6,蛋白表达量最高,且多数以可溶形式存在,33℃上清中的蛋白含量比37℃上清高。纯化的蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。【结论】成功克隆并表达了鸡Gal-3基因,其原核表达产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。 相似文献
4.
为探讨鸡β-防御素12（AvBD12）的生物学特性,试验采用RT-PCR方法从鸡脾脏组织中扩增到鸡AvBD12基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProex HTa上,进行原核表达。Tricine-SDS-PAGE电泳表明,重组鸡AvBD12融合蛋白分子质量约为14 ku。对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定,结果显示,纯化后的重组鸡AvBD12融合蛋白对金黄色葡萄球菌和兔波氏杆菌有较高抗菌活性,对猪霍乱沙门氏菌和乳酸菌的抗菌活性较弱。高盐浓度对其抗菌活性有显著影响。该重组蛋白对鸡红细胞无显著溶血活性。荧光定量PCR结果表明,AvBD12基因在所测定的15个鸡组织器官中均有表达。 相似文献
5.
[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。 相似文献
6.
[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组茵。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100％。鸡γ-干扰素蛋白合有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25％。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。 相似文献
7.
采用原核表达方法高效表达红鳍东方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因,并获得该基因的重组表达产物。通过RT-PCR扩增获得红鳍东方鲀防御素db-1基因成熟肽编码序列,将其连入pET32a+载体,构建原核表达载体pET32a-m DB-1,然后将其转入至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测该蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,最后以Anti-Mus defensin Beta2抗体为探针的Elisa反应鉴定该蛋白。结果表明:红鳍东方鲀db-1基因在大肠杆菌中高效表达,并纯化得到了这种重组防御素融合蛋白。本研究中提供了一种简单、高效获取重组防御素蛋白的方法,可为其应用和生产提供支持。 相似文献
8.
试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L-1,16 ℃,220 r·min-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。 相似文献
9.
通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达. 相似文献
10.
猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 相似文献