猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

吕文发  张英霞  欧阳红生  梁冠生  李树伟  张永亮 《中国兽医学报》2003,23(3):265-267

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2、R1),采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20 bp序列交叉重叠.F1长38 bp,R1长36 bp,其他片段均40bp长,F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶Nco I和Xho I的识别位点序列.经PCR扩增出254 bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体.从阳性细菌中提取质粒,经Nc0 I和Xho I酶切,回收254 bp目的片段,定向克隆到pET28a中,转化DH5.受体菌,提取质粒,再转化到BL21(DE3)中,成功筛选出阳性克隆.阳性菌经IPTG诱导,通过SDS PAGE,检测出猪肌生成抑制素的表达.  相似文献   

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达载体的构建     

李树伟  欧阳红生  张英霞  吕文发  李慎涛  张永亮  张玉静 《中国兽医学报》2003,23(6):610-612

从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。  相似文献   

溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区cDNA克隆及其原核表达   总被引：2，自引：0，他引：2  

吕文发  赵静  单雪松  王恒  吴伟 《畜牧兽医学报》2005,36(6):536-539

根据GenBank中鸡卵泡抑制素α亚基序列设计引物，对该序列按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶SacⅠ和XhoⅡ的识别位点序列。利用RT-PCR技术从溆浦鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素α亚基成熟区序列，经PCR扩增出354bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明成功地获得了抑制素α亚基编码序列的克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经SacⅠ和XhoⅠ酶切，回收354bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL21(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS-PAGE，检测出溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区的表达。  相似文献   

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测     

张锐孙美榕  欧阳红生  张玉静杨捷黄燕  陈绍红 《中国兽医科技》2003,33(10):22-26

构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。  相似文献   

猪肌生成抑制素（MSTN）cDNA的克隆   总被引：1，自引：0，他引：1  

李慎涛  廖晓萍等 《中国兽医学报》2001,21(1):31-34

从猪的肌生成抑制素（MSTN）编码序列中设计引物，以军牧一号猪肌细胞总PNA为模板，利用RT－PCR和嵌套PCR技术，扩增出MSTN cDNA片段。该片段全长1277bp，包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道的一致。经EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶解分析，cDNA片段与pMD18-T载本之间既有正向插入的克隆，也有反向插入的克隆，所得到的MSTN cDNA可用于原核和真核表达载体的构建。  相似文献   

猪生成抑制素(MSTN) cDNA的克隆   总被引：3，自引：1，他引：2  

李慎涛  孙博兴  欧阳红生  张玉静  廖晓萍  张锐  张永亮  吴文甲 《中国兽医学报》2001,21(1):31-34

从猪的肌生成抑制素(MSTN)编码序列中设计引物,以军牧一号猪肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和嵌套PCR技术,扩增出MSTNcDNA片段.该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列.将所得片段与pMD18-T载体连接,转化到JM109大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致.经EcoRⅠ和PstⅠ酶解分析,cDNA片段与pMD18-T载体之间既有正向插入的克隆,也有反向插入的克隆,所得到的MSTNcDNA可用于原核和真核表达载体的构建.  相似文献   

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定   总被引：18，自引：0，他引：18  

欧阳红生  孙燕  张永亮  李慎涛  张锐  廖晓萍  张玉静  赵建军  赵凤云 《中国兽医学报》2001,21(5):479-481

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。  相似文献   

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

杨连玉  杨文艳  赵颖彩  钱剑  王哲 《中国兽医学报》2005,25(6):614-616

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．  相似文献   

西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

吕文发  赵静  袁天祥 《中国牛业科学》2006,33(1):19-20,23

本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。  相似文献   

枯草杆菌多重耐药基因bmr的克隆及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

宋战昀  韩文瑜  雷连成  冯新 《中国兽医学报》2005,25(6):597-599

根据BenBank上已公布的多重耐药基因bmr的编码序列设计1对引物．以枯草杆菌基因组为模板，扩增出1170bp的DNA片段，将所得片段与pMD18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其扩增片段测序结果与文献报道序列同源性达98．81％。将该片段定向克隆到pET-28a（＋）表达质粒中。提取质粒转化到BL21（DE3）中，经1mmol／l。IPTG诱导阳性菌．通过SDS-PAGE检测出bmr基因的表达产物。  相似文献   

大肠杆菌多药耐药基因AcrA的克隆及其原核表达     

马红霞邓旭明  阎继业张英霞 欧阳红生 《兽医大学学报》2003,23(3):294-296

从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，扩增出AcrA基因中约691bp的cDNA片段，将所得片段与pMD—18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经HindⅢ和BamHI酶解，回收691bp的目的片段，定向克隆到pET—28a表达载体中，提取质粒，再次转化到BL21(DE3)中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS—PAGE检测出AcrA部分基因的表达。  相似文献   

Mhp强弱毒株P97基因的克隆与序列测定   总被引：1，自引：0，他引：1  

丁芳  宁宜宝 《畜牧兽医学报》2004,35(6):698-701

利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增出猪肺炎支原体弱毒株R659及强毒株F19的P97基因，PCR产物经纯化后，克隆至载体pGEM-Teasyvector，转化DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，对目的片段测序，结果表明：R659的P97全基因大小为3416bp，F19的P97全基因大小为3329bp，强弱毒株间核苷酸同源性为96．9％，弱毒株R659与标准株232A核苷酸同源性为95．6％，强毒株F19与232A株核苷酸同源性为95．1％。  相似文献   

抑制素与羊GM-CSF基因融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI的构建     

吴结革  茆达干  乔真真  沈辰辰 《畜牧与兽医》2008,40(9)

为构建抑制素基因与羊GM-CSF基因融合的真核表达质粒,通过EcoRI、XhoI酶切抑制素真核表达质粒pCISI、pEGISI及羊GM-CSF表达质粒pGM-CSF/SS,然后将GM-CSF基因分别插入pCISI、pEGISI,转化DH5α,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,进行酶切和测序鉴定。结果表明,构建的抑制素融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI正确,为研究GM-CSF基因对抑制素基因疫苗的免疫增强作用奠定了基础。  相似文献   

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中的表达     

李树伟  欧阳红生  吕文发  李莉  张永亮  李莲军 《动物医学进展》2005,26(9):59-61

将猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达质粒,采用脂质体法转染COS-7细胞,经RT-PCR检测,转染重组质粒的COS-7细胞MSTN mRNA呈阳性,表明该重组体能够在真核细胞中完成转录过程。SDS-PAGE电泳结果有43 ku目的蛋白表达带,并用Western blotting证实了其表达的特异性,表明猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列可以在真核细胞中表达。  相似文献   

大肠杆菌多药耐药基因AcrA的克隆及其原核表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

马红霞  邓旭明  阎继业  张英霞  欧阳红生 《中国兽医学报》2003,23(3):294-296

从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物,以大肠杆菌基因组为模板,扩增出AcrA基因中约691 bp的cDNA片段,将所得片段与pMD-18T载体连接,转化到DH5a大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经HindⅢ和BamH I酶解,回收691 bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出AcrA部分基因的表达.  相似文献   

牛抵抗素基因的克隆及原核表达     

黄建龙  王哲  张才  刘国文 《黑龙江畜牧兽医》2007,(10):14-16

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。  相似文献   

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达     

张忠芳  高士争  张曦  李士泽  张玉静 《中国兽医学报》2004,24(5):463-466

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白  相似文献   

三黄鸡a干扰素的克隆、表达及抗病毒活性初步研究     

李秋霞  刘永录  龚剑  马仲彬  陈乃壮  杨明锋  张国祖 《动物医学进展》2011,(10):63-66

采用PCR方法从三黄鸡血液基因组中扩增鸡α干扰素全基因,并克隆和测序.序列分析表明,基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp.将该片段与表达载体pET-28a连接克隆至大肠埃希菌DH5α菌株,经测序和酶切鉴定,选取正向插入、读码框正确的阳性克隆.构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,...  相似文献   

和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达     

姜仁军  李树伟  邓芳 《黑龙江畜牧兽医》2013,(5):42-46

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM₀01009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。  相似文献   

新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

余劲术  刘群  汪明 《中国兽医杂志》2006,42(4):3-6

本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础.  相似文献