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1.
旨在优化并建立有利于山羊类ES细胞生长的饲养层细胞、培养基、细胞因子和传代方法。本研究选择武汉市本地白山羊配种6～7 d后的胚胎,通过全胚培养法、酶消化与机械分离结合法分离山羊类ES细胞,并在不同的细胞饲养层中饲养、在培养基中添加不同的生长因子、采用不同的传代方法,比较不同培养条件对山羊类ES细胞生长和增殖的影响。通过碱性磷酸酶染色和免疫组化染色法鉴定ES细胞特异生物标记AKT、SSEA-1和Oct-4的表达,并将得到的山羊类ES细胞进行体外分化。结果表明,与小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibro-blast,MEF)和山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)相比,C2C12更有利于细胞的贴壁,但差异不显著(P>0.05);细胞传代时,在高浓度细胞因子LIF(Leukemia inhibitory factor)和SCF(Stemcell factor)中处理ICM(Inner cell mass),更有利于细胞传代(传至第8代);培养基中添加LIF和SCF的同时,添加肝素和胰岛素,更有利于细胞的传代(传至第9代);山羊类ES细胞中SSEA-1(... 相似文献
2.
为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。 相似文献
3.
从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示：致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞（SEF）上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）组。培养液中同时添加胎牛血清（FBS）和Knock-out血清替代品（KSR）,绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。 相似文献
4.
为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5~13.5 d ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高(42.9%,28.6%;75.0%,54.2%),ES细胞最高传至6代;培养液中添加10 ng/mL LIF+10 ng/mL SCF的效果比单独添加1种因子的效果好,最高传至6代,高于单独添加1种因子的传代数(4代,2代);用3种传代方法进行传代时,采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。 相似文献
5.
6.
将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。 相似文献
7.
为了优化ICR小鼠胚胎干细胞体外培养体系,本实验以ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5dICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了不同胚胎发育阶段、不同胰岛素添加量和不同生长因子对ICR小鼠类胚胎干细胞(mESCs)分离培养的影响。实验结果表明:囊胚期的胚胎贴壁率和内细胞团(inner cell mass,ICM)集落增殖率(82.4%、64.7%)显著高于桑葚胚期(54.2%、41.7%)(P0.05);在添加不同浓度胰岛素时,0、5、10mg/mL组的胚胎贴壁率和ICM集落增殖率差异均不显著(P0.05);添加生长因子组的胚胎贴壁率和ICM集落增殖率显著优于未添加组(P0.05),而添加组中单独添加SCF稍逊于单独添加LIF和2种因子一起添加的效果。 相似文献
8.
山羊类ES细胞的分离与克隆 总被引：6，自引：0，他引：6
采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。 相似文献
9.
建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用. 相似文献
10.
本研究以无血清培养基为基础培养液,旨在探求小鼠ES细胞条件培养液(ESCCM)和2种不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响.绵羊内细胞团从胚胎中分离得到后,分别以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)和绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)为饲养层进行培养.结果在MEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中可稳定传至第10代,而使用基础培养液最多传至5代.而在SEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中仅能传至3代.表明使用ESCCM和MEF能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆.对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且发现这些类ES细胞可以表达胚胎干细胞关键转录因子Nanog.结果表明,ESCCM可显著提高绵羊类ES细胞的分离克隆效率,原因可能是小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增殖的作用.且MEF比SEF更适合于绵羊类ES细胞的分离和传代. 相似文献
11.
比较了在无血清培养体系中分别添加小分子化学物质pluripotin(SCl)和白血病抑制因子(LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度.以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层,以含LIF的添加血清替代品(KSR)的培养基(ESC-SR)为对照,分别用SC1浓度为0.3、1、3μmol/L的ESC-SR培养液对昆明小鼠胚胎进行分离培养.结果显示:胚胎在添加3 μmol/L SC1的ESC-SR培养液中ICM形成率显著高于对照组(P＜0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态.不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为0.3 μmol/L组的F2代形成率显著高于1 μmol/L组和3μmol/L组(P＜0.05),所分离的细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog和Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点.结果表明,ESC-SR培养液中SC1可以替代LIF用于小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养. 相似文献
12.
以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。 相似文献
13.
《畜牧兽医学报》2015,(7)
本研究旨在探究牛类胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的多能性标记基因与表面标记,为优化牛类ES细胞培养条件和相关研究提供依据。利用2i/LIF培养液,通过全胚接种及机械传代法分离培养牛囊胚内细胞团(Inner cell mass,ICM),免疫荧光染色法检测其多能性标记基因与表面标记;qRT-PCR检测免疫磁珠法分选的牛囊胚ICM和滋养层细胞(Trophectoderm cell,TE)的多能性标记基因的差异表达结果。试验成功分离出了牛囊胚ICM克隆,并体外培养至第10代,且各代克隆均呈现出了典型的干细胞形态。结果表明,ICM表面标记SSEA1、SSEA4和TRA-1-60染色为阳性,且多能性标记基因OCT4、SOX2和NANOG在其中均有表达;OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表达存在差异(P0.05),其中SOX2的差异极显著(P0.01)。综上表明,2i/LIF培养液有助于牛囊胚ICM的培养;SOX2可能成为牛ICM克隆的候选多能性标记基因。 相似文献
14.
采用大鼠心肌条件培养基(RH CM)培养ICR小鼠的桑椹胚和囊胚,发现由囊胚分离的ES细胞传代后ES集落的出现率显著高于桑椹胚(P<0.05),囊胚更适合作为ES细胞分离克隆的材料。以RH CM为培养基的试验组ES细胞传代的平均时间间隔为38 h,对照组传代的时间间隔平均为78 h,两者差异显著(P<0.05)。表明RH CM能够促进ES细胞贴壁增殖和ES集落的形成,有效地维持ES细胞未分化状态。试验中设计的3 种培养条件对原代ES集落的形成影响不显著,但对传代后的ES集落的形成和传代的代次有显著差异。其中以MEF作饲养层,添加RH CM培养基的效果最好。 相似文献
15.
从本地槐山羊胎儿中,将原始生殖细胞与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊胚胎生殖(EG)细胞。结果表明:高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊EG细胞的分离与克隆;EG细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上EG细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊EG细胞分离与克隆的效率;胎龄为30～45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合做山羊EG细胞的分离培养。 相似文献
16.
将187枚山羊胚胎按如下方式培养在GEF饲养层上:①桑椹胚直接培养;②囊胚直接培养;③囊胚去透明带后培养;④囊胚去透明带并被撕裂成碎片后培养;⑤囊胚去透明带后胰蛋白酶消化成小细胞团培养。将上述培养所获取的18个内细胞团(ICM)均分为2组,第1组始终从生长物中挑取较为浓密的类ES细胞团传代,第2组始终让培养物生长到铺满培养皿(瓶)底再传代。结果显示:①桑椹胚、囊胚直接培养以及囊胚被消化成小细胞团后培养,均未获得ICM;囊胚去透明带后培养,获得ICM的数量占参试囊胚数的30%;囊胚去透明带并被撕裂成碎片后培养,获得ICM的数量占参试囊胚数的60%。②始终从培养物中挑取类ES细胞团进行传代,传至第4代后已无细胞可传;而将培养物培养至长满培养皿(瓶)底后再一起传代,细胞可传11代以上,且其中的类ES细胞团呈大量扩增趋势。 相似文献
17.
山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞 总被引：11，自引：1，他引：10
选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。 相似文献
18.
细胞因子与激素对山羊卵母细胞体外成熟及卵裂的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验研究了在培养液中添加不同浓度的GDNF、LIF、SCF及其不同组合对山羊卵母细胞体外成熟与卵裂的影响。结果表明:GDNF、LIF、SCF对山羊卵母细胞体外成熟有极显著影响(P<0.01),不同浓度间无显著影响(P>0.05),添加LIF卵母细胞体外成熟率极显著高于GDNF、SCF(P<0.01),添加GDNF、LIF对卵裂率有显著影响(P<0.05),添加SCF对卵裂率无影响(P>0.05);GDN+LIF+SCF组和GD-NF+LIF组卵母细胞成熟率极显著高于LIF+SCF和GDNF+SCF组(P<0.01),添加GDNF+SCF和LIF+SCF对卵母细胞体外成熟率无显著差异,可见,LIF和GDNF对山羊卵母细胞体外成熟有协同作用。胚胎的早期发育上GDNF+LIF+SCF组优于GDNF+LIF组优于LIF+SCF也优于GDNF+SCF,均能显著提高卵裂率。 相似文献
19.
20.
对影响小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）培养、克隆、分离、传代效果的因素进行了探索研究。应用223枚昆明白小鼠胚胎和20枚129品系小鼠胚胎的研究结果表明，129品系小鼠胚胎比昆明白小鼠胚胎更适合作为ES细胞建系的材料，两者FS出现率差异显著（P＜0．05）；以DMEM＋10％NBS＋10％FCS为基础培养液，分别加入LIF、胰岛素、LIF＋SCF，极显著提高昆明白小鼠胚胎贴壁率，ICM生长率及F1、F2出现率（P＜0．01），而在DMEM＋10％NBS＋10％FCS＋LIF＋SCF为培养液，得到昆明白小鼠胚胎最高贴壁率、ICM生长率及传代率；4dpc胚胎传代情况显著好于3．5dpc胚胎（P＜0．05）。 相似文献