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1.
采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达. 相似文献
2.
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1 CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1 CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。 相似文献
3.
【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达. 相似文献
4.
目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础,方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达.检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础. 相似文献
5.
利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。 相似文献
6.
通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体. 相似文献
7.
pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。 相似文献
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狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。 相似文献
10.
[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础. 相似文献
11.
目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达. 相似文献
12.
目的:研究宿主蛋白KRT8对HBV复制的影响.方法:体外培养稳定表达HBV的肝癌细胞株(HepG2.2.15),分别用干扰KRT8基因的siRNA转染HepG2.2.15细胞和高表达KRT8基因的质粒转染HepG2.2.15细胞.RT-PCR验证转染效率,荧光定量PCR检测转染48小时后的细胞上清液HBV DNA水平.用拉米夫定抑制HepG2.2.15细胞HBV复制,RT-PCR检测基因表达水平.对数据采用t检验和方差分析,p<0.05为差异有统计学意义.结果:干扰KRT8基因表达后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平与对照组相比下降34%～38%(p<0.05).高表达KRT8基因后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平是对照组的28倍(p<0.01).抑制细胞HBV DNA复制后,HepG2.2.15细胞KRT8mRNA水平与对照组相比,下降了24%,但统计学无明显差异.结论:抑制宿主KRT8基因表达具有抗病毒作用. 相似文献
13.
中华大蟾蜍g a l e c t i n - 3c D N A的克隆、序列分析及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR扩增出中华大蟾蜍Bufo gargarizans半乳糖凝聚素3(gal-3)cDNA全长开放读码框(ORF)并克隆至pGM-T载体,经DNA测序确定获得全长ORF序列(GenBank登录号为JN993733).序列分析表明中华大蟾蜍gal-3的ORF是由789个碱基组成,编码262个氨基酸残基组成的蛋白质.推导氨基酸序列同源性比较发现,中华大蟾蜍与非洲爪蟾Xenopus lavis同源性最高,为51%,与其他10种动物的同源性在41%～50%之间.SMART分析显示gal-3蛋白在136-259位氨基酸存在保守的半乳糖结合域.Net Phos预测gal-3在Ser-6和Ser-186有潜在的丝氨酸磷酸化位点.gal-3氨基酸序列构建的进化树符合传统动物分类学特点.经菌落PCR、双酶切和DNA测序确认gal-3的ORF正确插入原核表达载体pET-28b,表明原核表达用重组质粒构建成功,为研究其蛋白功能和生物学功能奠定了基础. 相似文献
14.
在用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜的组织培养过程中,常会伴生着试管苗玻璃化现象的发生,此现象的发生会降低转基因的频率.本试验结果表明,影响玻璃化发生的因素较多,包括激素体积质量分数、蔗糖体积质量分数、琼脂体积质量分数和接种密度等.其中,激素6-BA和ZT体积质量分数对诱芽率和玻璃化率都有显著影响,随着体积质量分数的升高,玻璃化率升高,以6-BA体积质量分数为1mg/L,ZT体积质量分数为2mg/L时结果较为理想.蔗糖体积质量分数和琼脂体积质量分数对玻璃化率也有显著影响,当二者体积质量分数升高,玻璃化率降低,同时诱芽率也降低.综合分析,当蔗糖体积质量分数为50g/L,琼脂体积质量分数为10g/L时最适宜.接种密度对玻璃化的发生有显著影响,密度越高,玻璃化倾向越严重,而密度对诱芽率影响不明显.试验结果分析发现,接种密度为20～30个/皿最适宜. 相似文献
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Bc A 9 - B a r n a s e转基因雄性不育烟草的获得 总被引：1，自引：0，他引：1
利用农杆菌介导法将大白菜启动子BcA9与Barnase的融合基因对烟草叶片进行遗传转化,经含Basta的筛选培养基连续筛选,获得了转基因再生植株.转基因植株经PCR扩增,表明BcA9-Barnase基因已整合到烟草基因组中.对转基因植株和野生型植株的花药发育进行细胞学比较观察,显示野生型植株的花药发育正常,花粉粒形态正常,活力高;而转基因植株则发生花药绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生等系列现象.转基因烟草植株最终表现为花药瘦小、自交不能正常结籽等.同时,在高温条件下转基因植株不育性稳定,无育性恢复现象. 相似文献
16.
为了考察群际威胁与对内群体及外群体支持决策的关系,以农村和城市两个大学生群体为被试,采用准实验方法进行了两个研究,结果发现:①两个研究中,农村组大学生体验到的威胁感显著高于城市大学生;②城市大学生感受到的群际威胁、群体认同可以显著负向预测对外群体的支持,产生了外群体厌恶决策;群体认同可以显著预测对内群体的支持,产生了内群体偏好决策;③农村大学生感受到的群际威胁可以显著的负向预测对外群体的支持,产生了外群体厌恶决策. 相似文献
17.
为了探索喀斯特地区植物接种丛枝菌根真菌后幼苗的耐旱适应性,我们对香樟Cinnamomum camphora进行了幼套球囊霉Glomus etunicatum、层状球囊霉Glomus lamellosum和摩西球囊霉Glomus mosseae的单独接种和混合接种处理.香樟苗接种80d后再进行60d的强度(维持田间持水量的35%～45%)、中度(维持田间持水量的50%～60%)、轻度(维持田间持水量的65%～75%)和正常浇水(维持田间持水量的80%～90%)的水分胁迫处理.用WinRhizo分析系统测定苗木根系形态指标.结果表明:水分和菌根真菌的交互作用使香樟幼苗根系形态发生改变,以适应土壤环境.中度水分胁迫能提高根系总长和根尖数量,但是水分胁迫降低了根系生物量的积累和根体积.根系生物量、根系总长,根系表面积、根体积和根尖数表现为接种处理高于非接种处理.非接种处理的根平均直径在重度和中度水分胁迫下显著增强.菌根真菌接种处理的根系,平均直径随水分胁迫增加而有所降低.相同胁迫下的不同菌种处理之间,幼套球囊霉和混合接种处理较摩西球囊霉和层状球囊霉有较高的菌根依赖性.而在同一接种处理条件下,中度水分胁迫的香樟幼苗具有较强的菌根依赖性,重度水分胁迫却降低了菌根依赖性.同一水分条件下混合接种和幼套球囊霉有较高的菌根依赖性. 相似文献
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采用双任务范式使被试将工作记忆信息保存在工作记忆当中并完成选择性注意任务,结果发现:视觉空间工作记忆负荷不能使熟悉面孔的干扰效应消失,语义工作记忆负荷使熟悉面孔的干扰效应在高知觉负荷条件下消失.因此,熟悉面孔在高知觉负荷条件下可能是以语义的方式存储在工作记忆当中,在低知觉负荷条件下可能是同时存储在视觉空间工作记忆和语义工作记忆中. 相似文献
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大孔树脂纯化翅果油树叶片多糖的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
该文研究了5种树脂对翅果油树叶片多糖的静态吸附及解析性能,选取出一种吸附和解析效果均较好的树脂进行了动态试验研究.结果表明:AB-8树脂对翅果油树叶片多糖的吸附和解析效果较好;AB-8树脂在吸附时间为100min,吸附液为30℃,pH值为7,最佳上样量与树脂比例为6∶1,吸附流速为1mL/min时吸附效果较好.用40mL的蒸馏水洗脱效果最好,洗脱率可达82.095%.对AB-8树脂的再生性能进行研究表明,树脂重复使用4次,其吸附能力仍较为稳定. 相似文献