共查询到20条相似文献，搜索用时 185 毫秒
1.
《家畜生态学报》2021,(6)
为了建立稳定干扰牛β-连环蛋白的牛肾细胞(MDBK)系,针对牛β-连环蛋白基因的mRNA设计3对shRNA引物序列,分别构建shRNA慢病毒干扰载体;将牛β-连环蛋白过表达载体和shRNA载体共转染293T细胞,检测shRNA的沉默效率;将筛选有效干扰β-连环蛋白的shRNA载体进行慢病毒包装,并利用包装好的重组慢病毒感染MDBK细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得单细胞克隆,传代培养后检测β-连环蛋白的表达,获得有效沉默牛β-连环蛋白的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛β-连环蛋白干扰载体pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3,均较好地沉默了β-连环蛋白的表达,经嘌呤霉素筛选和Western blot检测获得有效沉默β-连环蛋白的MDBK细胞系。该研究通过β-连环蛋白特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰牛β-连环蛋白的MDBK细胞系,为进一步探讨牛β-连环蛋白与病毒的相互作用及其分子机制奠定基础。 相似文献
2.
针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
3.
4.
《畜牧兽医学报》2017,(11)
旨在细胞水平上进一步探讨FUT2基因的功能及其在猪小肠上皮细胞受到F18大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)侵染时的调控机制,为提高仔猪对F18大肠杆菌病抵抗力的分子选育提供理论基础。运用Real-time PCR方法检测分析FUT2基因在大肠杆菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞前后的mRNA表达差异,并采用Western blotting方法检测大肠杆菌F18ab、F18ac感染小肠上皮细胞前后FUT2的蛋白表达差异;同时设计并构建猪FUT2基因慢病毒干扰载体,筛选并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系,检测FUT2基因沉默对其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表达以及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响。结果表明,在F18大肠杆菌感染和LPS诱导小肠上皮细胞后,FUT2基因的mRNA相对表达水平均极显著升高(P0.01),同时大肠杆菌感染后小肠上皮细胞的FUT2蛋白表达上升。此外,本研究成功构建FUT2基因慢病毒干扰载体,并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因的表达都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表达水平显著下调(P0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表达水平极显著下调(P0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表达水平未发生显著变化,同时FUT2基因沉默后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附能力显著降低。结果显示,FUT2基因低表达可能不利于仔猪大肠杆菌受体的形成,以增强猪小肠上皮细胞抵抗E.coli F18感染的能力,本试验结果同时为球系列鞘糖脂生物合成通路在仔猪抗大肠杆菌感染过程中的作用机制研究提供一定的理论基础和依据。 相似文献
5.
为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。 相似文献
6.
7.
《畜牧兽医学报》2015,(7)
本试验通过0.1和1μg·mL-1浓度的LPS诱导处理猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),分别在2、4、6h时利用实时荧光定量PCR方法检测TLR4及其信号通路相关基因(CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α)mRNA水平相对表达量,初步探讨猪小肠上皮细胞受到产肠毒素大肠杆菌侵扰发生炎症反应的相关分子反应机理。结果发现,两种浓度的LPS均使得所检测的TLR4及其信号通路相关基因表达量上调,诱导后4~6h的表达量急速上升,且高浓度的LPS诱导处理后各基因表达量上调倍数明显高于低浓度LPS诱导时各基因表达量上调倍数,高浓度的LPS对机体肠道的刺激引起了更为强烈的免疫反应,使正常机体更快地产生炎症反应。由此推测,大肠杆菌侵染猪肠道后将释放LPS,TLR4作为LPS的受体,受LPS诱导其表达量上调,进而引起TLR4信号途径的信号传递,传递过程中由于MyD88的依赖机制,MyD88表达量上调相对稳定,再经过级联免疫放大效应,大量的促炎细胞因子释放,导致炎症及腹泻水肿病的产生。 相似文献
8.
针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。 相似文献
9.
旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体，再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行慢病毒包装得到慢病毒颗粒并转导至PK 15细胞中，经嘌呤霉素初筛得到的多克隆细胞，接着以终点稀释法筛选获得稳定表达E165R蛋白的单克隆PK 15细胞系。通过PCR扩增、Western blot和间接免疫荧光鉴定构建的PK 15细胞系，进一步利用RT-qPCR技术检测NF-κB及炎症相关基因P65、IKBa、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平。结果表明，稳定过表达ASFV E165R蛋白的PK 15稳定细胞系构建成功，与对照细胞系相比，E165R蛋白显著增强NF-κB以及炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达。本结果为后续研究ASFV E165R对先天免疫信号通路的影响提供生物材料。 相似文献
10.
UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。 相似文献
11.
《畜牧与兽医》2016,(2):70-73
为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。 相似文献
12.
针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
13.
构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 相似文献
14.
15.
16.
为了探究RSAD2在羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)感染下的作用机制，本研究通过慢病毒系统构建RSAD2表达下调的山羊皮肤成纤维(goat skin fibroblast, GSF)细胞。在ORFV感染0、6 h时，分别对GSF细胞(空白对照组：C0、C6)、转染含无意义shRNA慢病毒载体的GSF细胞(阴性对照组：N0、N6)以及RSAD2表达下调的GSF细胞(试验组：R0、R6)进行转录组测序，分析RSAD2影响GSF细胞的免疫应答反应。结果表明，R6 vs R0有1 154个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)并显著富集到NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路。RT-qPCR验证了8个DEGs的表达，包括ACKR3、IL-1A、CCL20、SDC4、SESN2、PCK2、GADD45A和MKNK2。另外，IL-6在ORFV感染及RSAD2干扰后，表达均呈下降的趋势。在蛋白质互作网络中，IL-6蛋白被鉴定潜在的核心蛋白之一，提示其可能与RSAD2蛋白协同抵抗ORFV感染。本研究阐述了RSAD2表达下调GSF细胞在... 相似文献
17.
试验选取6头猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原、抗体均为阴性的30日龄断奶仔猪,无菌分离肺泡巨噬细胞(AMs),分4组进行体外培养:对照组、髓样分化因子88(MyD88)干扰组(干扰组)、PCV2感染组(PCV2组)、PCV2感染-MyD88干扰组(PCV2-干扰组)。采用小干扰RNA(siRNA)方法使MyD88基因沉默,并分别于培养后0、6、12、24和48h收集细胞及培养上清液。用荧光定量PCR法检测干扰效率,Western Blot方法检测细胞内MyD88蛋白的表达变化,ELISA方法检测培养上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的动态变化。结果显示,siRNA能使78%的MyD88基因沉默,并显著影响其蛋白表达;AMs中MyD88表达量,PCV2组从6h开始显著升高(P<0.05),PCV2-干扰组与PCV2组相比在12、24、48h差异极显著(P<0.01)。培养后各时间点,PCV2均能明显促进AMs分泌IL-1β(P<0.01或P<0.05),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-1β的分泌量均显著降低(P<0.05)。PCV2能显著增加感染后6和12hIL-6的分泌量(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-6的分泌量在6和12h显著降低(P<0.05)。PCV2明显促进感染后12、24和48hAMs分泌IL-10的能力(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-10的含量在24和48h均极显著的降低(P<0.01)。结果表明,PCV2可引起体外培养的PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10发生不同的变化,而MyD88是引起这些变化的重要调节因子。 相似文献
18.
《中国畜牧兽医》2016,(5)
为探究Toll样受体(TLRs)介导的信号通路在马链球菌马亚种(S.equi)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用,收集S.equi感染后不同时间点的RAW264.7细胞,提取总RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞Toll样受体1、2、6(TLR1、TLR2、TLR6)、接头蛋白骨髓分化蛋白88(MyD88)及细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染RAW264.7细胞后6h时,TLR1、TLR2、TLR6与MyD88mRNA水平均较对照组没有显著差异(P0.05);感染后12h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达量未出现明显上升(P0.05),而MyD88mRNA水平极显著升高(P0.01);感染后24h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达水平出现极显著升高(P0.01),MyD88 mRNA表达没有显著变化(P0.05),且IL-10和IL-12mRNA水平与对照组相比极显著升高(P0.01),IL-1、IL-6和TNF-αmRNA水平均极显著下降(P0.01)。结果表明,TLRs介导的信号通路参与S.equi感染RAW264.7细胞的免疫应答反应。 相似文献
19.
《畜牧兽医学报》2016,(4)
本研究以绒山羊肌内脂肪细胞为试验材料,通过靶向阻断过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因,建立稳定干扰的肌内脂肪细胞株,探讨绒山羊PPARγ基因在肌内脂肪细胞增殖和分化过程中的功能。采用慢病毒质粒包装系统构建特异靶向白绒山羊PPARγ基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,用以建立PPARγ基因稳定沉默的肌内脂肪细胞株。利用实时定量和Western blot方法检测PPARγ基因在干扰组和对照组不同时间点的表达情况,并通过MTT和油红O染色法研究绒山羊PPARγ基因对肌内脂肪细胞增殖和分化的影响。经测序证实合成的含PPARγ-shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确,对肌内脂肪细胞的感染效率为80%以上,荧光定量和Western blot检测慢病毒介导的shRNA可以有效降低PPARγ的表达,其mRNA和蛋白水平作用的时间相隔24h。沉默PPARγ基因后,脂肪细胞内甘油三脂的浓度明显低于对照组,相反MTT检测干扰组中细胞增殖能力高于对照组。本研究构建了绒山羊shRNA-PPARγ慢病毒干扰载体,成功转染至肌内脂肪细胞后可明显抑制脂肪细胞的分化,而促进肌内脂肪细胞的增殖,为进一步研究PPARγ基因在绒山羊脂肪细胞代谢通路中的作用及脂肪沉积机制奠定基础。 相似文献
20.
探究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对口蹄疫病毒复制的抑制作用,本研究选取O型口蹄疫病毒ON株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2,依据RNAi的原理构建6个shRNA的重组表达质粒,转染BHK21细胞后并接种ON口蹄疫病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒;将能够高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并筛选稳定的BHK21细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对ON口蹄疫病毒复制的抑制作用。结果显示,构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%~93.2%,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%~95.49%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制的基因干扰片段,并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒的转基因羊生产培育奠定了实验基础。 相似文献