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1.
高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。 相似文献
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本研究旨在分离克隆水稻根特异表达的启动子,为育种提供资源.本实验结合本室芯片数据库和RT-PCR验证得到一个水稻根特异表达的基因(TIGR Locus:Loc_Os05g19570),采用PCR技术从MH63的基因组DNA中扩增其上游启动子P12,长度为1950 bp,将该启动子片段与报告基因gus相连,构建植物表达载体,农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导转化水稻(Oryzative ssp.japonica)中花11.组织化学分析及荧光定量测定显示该启动子具有根特异性及时间差异性.根据P12启动子序列特征,利用PCR对其进行有目的的缺失,将5个长度不同的缺失片段分别与gus相连,构建植物表达载体,转化水稻中花11.荧光定量测定结果表明:-1059～-819bp区域缺失后,报告基因在根里的表达量显著降低,说明这个区域可能存在顺式元件.本研究成功的分离克隆到一个水稻根特异的启动子P12,进一步分析发现其还具有时间差异性. 相似文献
3.
拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。 相似文献
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为了研究多基因互作,减少多次转化的不确定性,本研究在花青素合成调节基因del(delila)和ros(rosea1)的上下游分别引入CaMV 35S启动子和nos终止子,以pBI121-del和pCAMBIA1301-ros做中间载体,并利用BamHⅠ和BglⅡ产生相同4碱基末端的片段,在连接酶的作用下将CaMV 35S启动子分别驱动的del和ros基因构建在同一个植物表达载体pCAMBIA2301上,利用所构建的载体pCAMBIA2301-delros通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.),并进行PCR检测,获得转基因草莓。通过组织观察发现,转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色;实时RT-PCR分析表明,在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)、查尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase,CHI)、查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)、二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase,UFGT)在转基因株系中的表达均上调,这也进一步证实通过该方法构建的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros可以用来转化植物。本研究结果表明,植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros成功构建,为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路,也为在植物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。 相似文献
5.
本研究利用PCR技术从三倍体毛白杨（（Populus tomentosaxP．bolleana）xP．tomentosa）基因组DNA中扩增获得抗病相关PtDRG02基因的一个启动子区（包括其下游5’端非编码区序列）,命名为Ptp01。以β-葡萄糖苷酸酶（舢）基因为报告基因,构建了PtDRG02基因启动子植物表达载体Ptp01／gus。以根癌农杆菌EHA105及LBA4404感受态细胞为受体,转化植物表达载体Ptp01／gus进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动gus报告基因在毛白杨叶片组织中表达,但表达强度弱于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。 相似文献
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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。 相似文献
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为了抑制木薯支链淀粉的合成,提高直链淀粉含量,改变木薯淀粉结构,培育工业用燃料酒精型木薯品种,本研究利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEI的部分片段,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同源性为99.22％;并以pBI121为基础,构建了以块根特异性表达启动子Sporamin驱动的SBEI基因反义结构的植物表达载体。 相似文献
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马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。 相似文献
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选择标记基因的剔除是转基因植物商品化种植的重要基础.为建立小麦(Triticum aestivum)低温诱导的位点特异性标记基因删除体系,本研究以小麦西农928基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得小麦低温诱导表达wcs120启动子,序列分析表明,该序列与GenBank中序列AF031235相比有一段21 bp插入,与AY493570.1序列完全一致.以含有CinH/RS2单向位点特异性重组系统的植物表达载体pXL5513为框架,成功构建了包含有抗旱相关性基因PYL5(pyrabactin-resistance like gene 5)表达框的低温诱导的位点特异性重组植物表达载体pXL5513-fwcs-RDA;并对小麦绵阳19(M19)幼胚愈伤组织进行基因枪转化,1 745块愈伤组织经筛选分化共获得9株转基因植株,经PYL5基因特异引物PCR检测,6株为阳性植株,低温春化处理后经删除引物PCR检测,6株阳性植株初步证实成功删除了选择标记基因.本研究为利用低温诱导的位点特异性重组系统进行小麦无标记基因转化奠定了基础. 相似文献
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果胶酯酶(pectin methylesterase,PME)催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化,可以降解植物细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关。本研究根据白梨果胶酯酶基因PcPME4的序列,设计一对含有特定酶切位点的特异性引物,以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)cDNA为模板通过PCR扩增得到一段294bp的PME基因片段。将片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建PME基因的反义表达载体pBI121-AsPME。将pBI121-AsPME电转化农杆菌EHA105,利用含pBI121-AsPME的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后于抗性培养基中诱导愈伤组织,获得的抗性愈伤组织经PCR初步检测含有反向PME基因片段,荧光定量PCR检测结果显示受侵染的愈伤组织中PME基因表达量降低,表明反向插入的PME基因片段起到了抑制内源基因表达的效果。 相似文献
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向日葵种子特异性启动子Ha ds10G1的克隆及其功能验证 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR技术从向日葵基因组DNA中克隆了Lea蛋白基因家族中Ha ds10 G1基因上游1414bp的调控序列，序列分析表明-1—1414bp与报道序列同源性为100%，将其与GUS基因融合构建植物表达载体后，通过农杆菌介导法转化烟草NC89，PCR扩增初步证明目的片段已整合到烟草基因组中，转基因植株的GUS活性检测表明，在茎、叶中无GUS活性，GUS活性只存在于种子中，因此，Ha ds10 G1启动子具有种子特异性的功能。 相似文献
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组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。 相似文献
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用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体 总被引：4，自引：0，他引：4
家蚕（Bombyx mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一，若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到重要的意义。研究从天蛹中提取家蚕基因组DNA，用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0.5kb两个片段。DNA序列分析表明，不同蚕品种2－7外显子范围内DNA序列源性达95．7％。用PCR的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列，并克隆到轻链基因的5kb和0.5kb两个片段中间，使GFP基因具有正确的读码框，能和轻链蛋白融合表达。将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG，用于家蚕丝腺生物反应器的研究。 相似文献
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本研究通过PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了3个理论推断与耐寒相关的miRNA片段（miRNA402,miRNA319和miRNA393）和1个与植物生长相关的片段miRNA172。利用重叠延伸PCR技术将miRNA172小分子,以及3个与耐寒相关的miRNA402,miRNA319和miRNA393小分子串连在一起分别导入植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA,取代表达载体中的GUS基因,构建了pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir31＋402＋393-pA融合表达载体。经PCR和双酶切及测序鉴定,pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir319＋402＋393-pA构建成功,为后续利用基因工程手段,miRNA转化木薯,提高木薯生长和木薯耐寒相关研究奠定基础。 相似文献
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应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献
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设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。 相似文献
17.
超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据. 相似文献
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Gateway^TM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体 总被引：2，自引：0，他引：2
设计含有attB侧翼序列的引物,用于番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)的外壳蛋白基因(CP)基因的PCR扩增.在BP重组酶的作用下,将CP基因与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆.在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,再进行平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应.结果证明,用限制性内切酶Xho I酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳获得了预期长度为1700 bp的重组片段;以启动子和外壳蛋白基因及外壳蛋白基因和终止子序列为基础,分别设计2对引物,经PCR扩增分别获得582和773 bp片段.结果表明,获得了含有内含子的CP基因反向重复结构的表达载体. 相似文献
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3-磷酸-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)广泛地存在于各种生物体内,是生物体内糖异生和糖酵解过程中的关键酶。为了获取长武134小麦(TriticumaestivumL.)GAPDH上游序列并分析其启动子活性,本研究根据小麦GAPDH基因(GenBank登录号:EF592180.1)5'端序列设计特异引物,利用基因组步移法获得了该基因上游1071bp的序列;对该序列进行结构分析表明,转录起始位点可能位于起始密码子上游约700bp处;PlantCARE预测瞬时作用元件表明,在翻译起始密码子ATG的上游含有启动子基本结构元件TATA-box、CAAT框,以及能够应答脱落酸(abscisic acid,ABA)、干旱、低温等非生物胁迫逆境因子的多种顺式作用元件(如MYB、MYC、WRKY、ABRE、HSE和GT-1等);然后用GAPDH基因启动子序列替换植物表达载体pBI121GUS基因前的CaMV35S启动子,并构建启动子融合表达载体,并通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105介导转化烟草(Nicotianatabacum)叶盘进行了瞬时表达分析,以GUS作为报告基因研究在ABA、干旱、低温3种非生物胁迫下启动子的活性。结果显示,ABA、低温和干旱对启动子有较明显的诱导效应,其中以干旱诱导最为显著。本研究通过基因组步移克隆得到GAPDH基因的启动子,分析表明此启动子为有着强启动活性的诱导型启动子。 相似文献
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根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。 相似文献