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1.
α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。 相似文献
2.
玉米赤霉烯酮(ZEN)是具有雌激素作用的次生代谢产物,可以被来源于Gliocladium roseum的内酯水解酶降解为无毒物质。为了实现玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达,获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,本研究采用一步克隆及重叠延伸PCR的方法构建了单启动子和包含Hpa Ⅱ和P43双启动子的表达质粒,将质粒转化到枯草芽孢杆菌中,获得重组菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。然后构建了重组整合载体amy-p43-zlhy,将zlhy-6基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组中。通过Cre/lox系统敲除抗生素抗性基因,获得整合了P43-zlhy表达盒的食品级重组枯草芽孢杆菌BZ-zlhy。将构建的3个重组菌株在37℃、pH值7.5条件下培养36 h,结果显示,双启动子表达载体重组菌株的最高酶活性为2.2 U·mL-1,是单启动子菌株的1.2倍。双启动子重组菌株表达的降解酶对ZEN(4 μg·mL -1,30 min)的降解率为65.1%。重组菌株枯草芽孢杆菌BZ-zlhy表达水平最低(0.4 U·mL-1)。本研究实现了玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中表达,同时构建了不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产奠定了基础,也为解决粮食储藏和饲料生产中的ZEN污染提供了思路。 相似文献
3.
Bt cry I A(c)杀虫基因向棉花内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
将来自Bacillusthuringiensis
subsp.kurstaki的BtcryIA(c)杀虫基因通过综合质粒载体pBC601,整合到棉花(Gossypium
hirsutum)优势内生细菌Bacillusceieus(Bc9002)的染色体上,得到的工程菌对棉铃虫(Helicoverpa
armigera Hb.)有杀虫活性.此综合质粒含有能在营养期表达Btcry IA(c)基因的强启动子、cryIA纠杀虫基因、四环素抗性标记基因tet'、8.0kb的EcoRI-NcoIB.ceieus染色体片段.将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中,综合质粒因含B.cereus染色体片段,可与B.
cereus染色体发生同源重组,从而将BtcryIA(c)基因整合到B.cereus的染色体上.通过对转化子的DNA酶切分析、PCR扩增、SDS-PAGE凝胶电泳检测、ELISA检测、电镜观察、毒力测定,结果表明Btcry
IA(c)基因已经整合到内生细菌Bc9002的染色体上,并可高效表达. 相似文献
4.
本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性。通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91％,而种间同源性为60％～69％。 相似文献
5.
Bt cry I A（c） 杀虫基因向棉内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
将来自Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki的Bt CRy I A(c) 杀虫基因通过综合质粒载体pBC601，整合到棉花（Gossypium hirsutum)优势内生细菌Bacillus cereus(Bc9002)的染色体上，得到的工程菌对棉铃虫（Helicoverpa armigera Hb.)有杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达Bt cry I A(c) 基因的强启动子，cry I A(c)杀虫基因，四环素抗性标记基因tet^r 8.0kb的EcoR I-Nco I B.cereus染色体片段。将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中，综合质粒因含B.cereus染色体片段，可与B.cereus染色体发生同源重组，从而将Bt cry I A(c)基因整合到B.cereus的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析，PCR扩增，SDS－PAGE凝胶电泳检测，ELISA检测，电镜观察，毒力测定。结果表明Bt cry I A(c)基因已经整合到内生细胞Bc9002的染色体上，并可高效表达。 相似文献
6.
蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达 总被引：7，自引：3，他引：7
实验成功地构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15，抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^＋表型分析表明，目标基因已经重组到宿主基因组染色体上；0．5％甲醇诱导表达后，SDS—PAGE结果显示，表达蛋白的相对分子量约为23kD，活性电泳出现明显活性条带；酶活性测定显示，重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右；氯仿-乙醇（3：5／V：V）和KCN（5mmol／L）抑制反应进一步证明，所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。 相似文献
7.
LsICE1基因是从生菜中分离的一个低温胁迫转录因子,过表达LsICE1基因的转基因水稻提高了抗寒能力。LsICE1基因在生菜的根、茎、叶中为组成型表达,其中叶的表达量较强。LsICE1基因的表达水平能被冷、ABA和NaCl处理所上调,但不被脱水处理上调。卡方测验表明,转基因T1水稻潮霉素抗性发生了3∶1抗性分离模式,大多数转基因植株中LsICE1基因是以单拷贝、单位点整合到水稻基因组中。Southern和Northern杂交检测结果表明,3个抗冷的转基因株系中LsICE1基因均是以单拷贝、单位点整合到水稻基因组中,并正常表达。冷胁迫下,LsICE1基因的超表达对水稻的OsDREB1A基因影响较大,表明LsICE1基因对转基因水稻抗寒性影响依赖OsDREB1冷反应通路。 相似文献
8.
双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性 总被引：2，自引：0，他引：2
研究和利用不同苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程虫剂，预防和延缓害虫抗性的重要途径。BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有主毒力，质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌（Echerichia coli)－枯草芽孢杆菌（B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因。将含Btcry1A,cry1Ac和cry2Aa全长基因的Bam HI/PstI,Bam H I/Xho I和Sma I(Bam H I)HindⅢDNA片段与pHT-BSK的应酶切产物连接，获得了单价cry/km^r组合的重组质粒pBlue-1Ab-km^r,pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因／km^r组合重组质粒pBlue-crylAb-km^r-2Aa和pBlue-cry1Ac-km^4-2Aa，重组质粒中所有cry基因与km^r均形成特异的Bam H I片段。限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接。含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米暝（Ostrinia furnacalis)的杀虫活性，对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因，但对玉米螟它们之间没有明显差异。研究为进一步阐明Bt cry 2Aa与cry1Ab和cry 1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件。 相似文献
9.
为了实现人白血病抑制因子基因(hLIF)在奶山羊乳腺上皮细胞中的稳定表达,本实验利用条件重组元件LoxP序列、山羊β-酪蛋白5'和3'同源臂、正负向筛选标记基因和hLIF基因构建hLIF基因打靶载体。脂质体法转染奶山羊(capra hircus)乳腺上皮细胞,进行遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选获得同源重组的阳性克隆,并通过PCR、实时定量PCR和Western blot检测阳性克隆中hLIF基因的表达情况。酶切和测序分析结果显示,实验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。阳性克隆经PCR、实时定量PCR和Western blot均检测到了目的条带。表明打靶载体pLoxP-NT53L已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊生产提供了打靶载体。 相似文献
10.
以木聚糖酶基因为研究对象,构建了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从芽胞杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA中分别扩增出完整和不带启动子的木聚糖酶(xynA)基因;利用芽胞杆菌的强启动子,即S-层蛋白的启动子,通过SOE(splicing by overlapping extension)法连接到xynA基因上得到重组基因S-xynA,将xynA和S-xynA分别装载到整合载体pDG1730上,转化α-淀粉酶高产菌株枯草芽胞杆菌B47,将重组基因整合到α-淀粉酶基因上,以期目标基因像淀粉酶基因一样高效表达。结果表明,2个重组菌的产酶活性均得到提高,其中S-层蛋白启动子表达的木聚糖酶活是自身启动子表达的酶活的1.69倍。重组表达的木聚糖酶在pH5~8和40~60℃范围内均具有较高活性。 相似文献
11.
枯草杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列。经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员。该基因已注册GenBank（GenBank注册号：DQ269473）。将该基因构建到大肠杆菌表达载体pET-32a并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3），经过诱导获得了此酶的高效表达. 相似文献
12.
所研究的蜡状芽孢杆菌RC可以在镉浓度为200mg·L-1的固体培养基平板上生长良好,表明菌株具有强抗镉的能力。该菌株在液体培养基中Cd2＋、Cr3＋、Pb2＋浓度均为75mg·L-1和Mn2＋浓度为100mg·L-1培养时,菌株生长正常。在重金属Cr3＋、Pb2＋、Mn2＋存在时,采用红外光谱与原子吸收光谱分析菌株对Cd2＋的积累,结果表明,培养基中其他重金属离子的加入,会影响菌株对Cd2＋的积累率;当Cr3＋存在时,Cr3＋可以增加细胞壁上有效官能团活性,明显提高RC菌体对Cd2＋的积累率,而其他重金属组合对Cd2＋吸附积累能力影响不大;RC细胞壁上活性基团-OH、-NH-、-COOH、-PO34-和-M-O（O-M-O）活跃参与Cr3＋、Pb2＋、Mn2＋和Cd2＋多种重金属离子的络合作用。通过高温和十二烷基硫酸钠处理菌株进行质粒消除试验,未发现该菌株的抗镉性质与抗性质粒的存在相关。 相似文献
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植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用 总被引：1，自引：0，他引：1
以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。 相似文献
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根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性,以不改变氨基酸序列为原则,对源于蜡样芽孢杆菌M22（Bacillus cerues M22）的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成新的基因序列Mn-SOD-2。构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体。结果表明,所构建的酵母工程菌株YM103,经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量为24kD,与预期大小一致。酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好。 相似文献
15.
Park HJ Lee JY Hwang IS Yun BS Kim BS Hwang BK 《Journal of agricultural and food chemistry》2006,54(8):3041-3046
The actinomycete strain LS-A24 active against some plant fungal and oomycete pathogens was isolated from a soil sample of the Sunghwan Lake in Korea. The cell wall composition and spore shape of strain LS-A24 were LL-diaminopimelic acid and spiral type, respectively. On the basis of the physiological and biochemical characteristics and 16S ribosomal DNA sequence analysis, strain LS-A24 was identical to Streptomyces roseoflavus. An antifungal and antioomycete antibiotic was isolated from LS-A24 using various chromatographic procedures. The molecular formular of the antibiotic was determined to be C(28)H(26)N(4)O(3), and on the basis of the NMR data, the antibiotic was confirmed to be staurosporine, 2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one. Staurosporine completely inhibited the mycelial growth of Colletotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, and Cladosporium cucumerinum with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 1-50 microg/mL for MICs. Staurosporine also was active against Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis ssp. subtilis, and Xanthomonas vesicatoria. Staurosporine and the commercial fungicide metalaxyl inhibited the development of Phytophthora blight on pepper plants. However, the control efficacy of staurosporine against the Phytophthora disease was somewhat less than that of metalaxyl. This is the first study to isolate staurosporine from S. roseoflavus and demonstrate its in vitro and in vivo antioomycete activity against P. capsici. 相似文献
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转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。 相似文献
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原生质体融合构建防病、杀虫和内生多功能工程菌 总被引：5，自引：0，他引：5
摘要：将含vip3A基因的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和具有内生及防病等优良特性的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)进行原生质体融合，构建了1株多功能工程菌, 经PCR检测vip3A基因呈阳性，并测定了融合子对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的拮抗作用、对小菜蛾(Plutella xylostella)毒性及内生定殖能力。实验结果显示多功能工程菌对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用，对小菜蛾的校正杀虫效率在59%以上，并具有内生定殖能力。 相似文献
18.
摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。 相似文献