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油茶总RNA及mRNA的分离与纯化 总被引：19，自引：3，他引：16
利用改良的CTAB法，从富含本分类糖类等次生物质油茶叶片中分离出总RNA，并从总RNA中，通过两次过Oligo(dT）柱分离纯化得到mRNA。实验结果证明：所提取的RNA和mRNA完整，质量较高，并应用到油茶cDNA文库的构建。 相似文献
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枸杞叶片cDNA文库的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNAIsolationSystem分离mRNA,然后用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSystem合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装,在国内外首次构建出滴度为2 78×105pfu/mL,重组效率为88 1%的枸杞叶片cDNA文库。 相似文献
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体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。 相似文献
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玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价 总被引：1，自引：0，他引：1
以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。 相似文献
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山葡萄总RNA提取方法的比较 总被引：1，自引：0，他引：1
以山葡萄成熟果皮及叶片为材料,对改良CTAB法,SDS法和Trizol法3种不同的总RNA提取方法进行了比较。结果表明,SDS法和Trizol法提取的总RNA均有拖带现象,有部分降解,Trizol法提取的总RNA中有DNA的污染;改良CTAB法提取山葡萄叶片和果皮的总RNA带形完整,28SrRNA和18SrRNA的荧光亮度接近2：1,A260／280值为1．8～2．0,该方法提取的总RNA纯度和提取量最高,提取出的总RNA可用于进行RT-PCR、构建cDNA文库等分子生物学的研究。 相似文献
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枸杞中IPP异构酶相关基因(IPI)的分离 总被引：2，自引：0，他引：2
以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATract mRNA I-solation System(Promega公司)分离mRNA,然后利用Universal RibocloneRcDNA Synthesis System(Pro-mega公司)合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用PackageneLambda DNA Packaging System进行包装,构建出滴度为2.78×105pfu/mL,重组效率为88.1%的枸杞叶片cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草IPI探针,并对枸杞叶片cDNA文库进行筛选,获得7个IPIcDNA阳性克隆。释放质粒后,进行酶切鉴定,IPI阳性克隆cDNA插入片段的大小为1.5 kb左右。 相似文献
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为了研究甘蔗(Saccharum officinarum L.)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的互作机制,构建感染SCMV的甘蔗叶片的酵母双杂交cDNA文库。以热带种Badila为供试材料,提取感染SCMV植株的叶片总RNA,分离纯化获得mRNA,通过反转录反应合成3种读码框的双链cDNA。用Gateway技术,通过BP和LR反应,将cDNA迅速重组到酵母双杂交载体pGADT7-DEST上,构建酵母双杂交文库。结果表明,文库容量为2.0×107cfu,随机挑取24个克隆检测,重组率为100%,cDNA插入片段长度主要分布在1kb~2kb,文库质量较好。说明该文库的构建为筛选与SCMV互作的甘蔗寄主因子基因,研究甘蔗与SCMV的互作机制及甘蔗抗花叶病育种奠定基础。 相似文献
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为深入挖掘匍匐翦股颖高温胁迫相关基因，本研究以高温处理的匍匐翦股颖叶片为试验材料，用Trizol法提取其总RNA，再用SMART技术进行双链cDNA的合成及回收纯化，并与pDONR222/pGADT7-DEST载体相连接，完成匍匐翦股颖酵母cDNA文库的构建。通过试验构建了质量较好的匍匐翦股颖酵母cDNA文库，文库容量为1.36×107 CFU，所插入的匍匐翦股颖平均片段长度> 1 000 bp，选取的24个克隆经过PCR检测全部能够显示出条带，重组率为100%。通过使用SMART技术建立酵母cDNA文库的方法，获得了质量较高的匍匐翦股颖cDNA文库，为研究匍匐翦股颖相关基因的蛋白筛选试验做准备。 相似文献
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[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。 相似文献
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羊草几丁质酶ClassⅡ基因的克隆、生物信息学分析及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已报道的羊草几丁质酶基因的EST序列,利用RACE技术,从100 mmol/L Na2CO3胁迫的羊草叶片中克隆得到羊草几丁质酶基因cDNA序列全长(GenBank登录号为GQ397277),命名为LcChi2基因。经序列测定和生物信息学分析,结果表明该序列开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸,为Ⅱ类几丁质酶,属于19家族,分子量约为27.4 kDa,预测等电点为8.67,与小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oryza sativa)等植物的几丁质酶具有高度的同源性,序列相似性分别为96.5%、965%、95.2%和80.5%,推测LcChi2蛋白与其他几丁质酶执行相似的功能。在大肠杆菌中进行了原核表达,为后期植物转化的验证准备多克隆抗体。本研究所获得的信息为今后对羊草几丁质酶基因功能的进一步研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础. 相似文献
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[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。 相似文献
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以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。 相似文献
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[目的]克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列,为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供参考.[方法]根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物,以石栗幼嫩叶片为材料,利用简并PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列,扩增其编码序列.[结果]扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序列长1789 bp,包含1509 bp的开放阅读框,可编码503个氨基酸,GenBank登录号为KC255250,并命名为amaccD.石栗accD基因序列经BLASTx比对后,发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90％、90％和89％.[结论]克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性. 相似文献
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甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆与分析燕麦肌动蛋白基因片段.【方法】根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以燕麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,进而转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞.阳性克隆经PCR鉴定后进行测序.【结果】扩增片段长678bp,共编码225个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.【结论】系统进化分析表明,扩增到的燕麦肌动蛋白基因与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切. 相似文献
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[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(interferon γ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆。对其序列分析结果显示,该序列包含119bp的5’非编码区,218bp的3’非编码区,开放阅读框ORF长537bp,共编码178个氨基酸,在其3’非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列其具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。 相似文献
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[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10cDNA共1117bp,包含55bp的5’端非编码区,一个540bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522bp的3’端非编码区。其中,3’非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。 相似文献