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为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4。将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_NCPA_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_NCPA_(m4)与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF_NCPA_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF_NCPA_(m4)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF_NCPA_(m4)无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF_NCPA_(m4)对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(8):1500-1505
为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。 相似文献
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魏氏梭菌是引起各种坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是引起创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一,其致病因子是该菌产生的外毒素。根据主要致病的毒素α、β、ε和ι,将该菌分为A、B、C、D、E 5个毒素型。各型魏氏梭菌均产生α毒素,它是魏氏梭菌最主要的毒力因子。α毒素是依赖锌离子的磷脂酶C,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(1)
本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPA_(C2)),经人工合成获得基因片段GCPA_(C2)。将GCPA_(C2)克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(C2)。利用Western Blot方法检测rCPA_(C2)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPA_(C2)免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_(C2)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPA_(C2)主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA_(C2)具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。 相似文献
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根据羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了羊魏氏梭菌PCR检测方法。该方法扩增条带大小为255 bp,最低核酸检测量A型为0.39 ng/L、B型为0.62 ng/L、C型为0.52 ng/L、D型为0.87 ng/L、E型为0.92 ng/L,而对羊大肠杆菌、羊链球菌、金黄色葡萄球菌、羊多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对54份临床样本进行检测,PCR检测结果高于细菌学和生化检测结果。结果表明,该PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床羊魏氏梭菌病的早期快速诊断。 相似文献
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正以往,坏死性肠炎多在肉鸡群中发生,蛋鸡出现坏死性肠炎的现象很少见。但是近年来,在蛋鸡养殖过程中,坏死性肠炎的发病率呈逐步增加的趋势,而且治疗难度和费用也越来越大。因此,必须引起蛋鸡养殖户的高度重视。1发病原因坏死性肠炎的致病菌是A型或C型魏氏梭菌,也叫产气荚膜梭菌,是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌。繁殖过程中,A型魏氏梭菌可产生α毒素,C型魏氏梭菌可产生α、β毒素,这两种毒素可 相似文献
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我国主要经济动物魏氏梭菌分离及血清型鉴定 总被引：8，自引：0，他引：8
对分离于7种经济动物的98株魏氏梭菌疑似物进行理化性质鉴定表明，分离菌符合魏氏梭菌特征。中和试验证实，分离于兔、狐狸、貉、水貂、麝鼠、犬的菌株均为A型；分离于鹿的菌株85．4％（35／41）为A型，14．6％（6／41）为C型，说明目前我国经济动物魏氏梭菌感染以A型为主。 相似文献
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[目的]检测信阳水牛群体GHRH基因的SNP多态性。[方法]以56头信阳水牛为材料,采集血样,提取基因组DNA,以GenBank公布的牛GHRH基因(gi:194719389)序列作为参照序列,设计PCR引物,采用PCR-SSCP和DNA测序方法对该基因第二外显子的进行突变检测。[结果]经SSCP分析发现,这些个体总共出现六种不同的带型。测序结果表明:位于GHRH基因的4 461bp、4 529bp、4 845bp、5 053bp和5 058bp处分别存在C→T、T→G、G→A、G→A和G→T五个单核苷酸突变。[结论]表明该基因在信阳水牛群体中单核苷酸多态较为丰富。 相似文献
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Chongli Xu Yuhan She Yimin Lin Chongbo Xu 《Journal of animal physiology and animal nutrition》2020,104(2):725-734
In order to interpret the molecular structure and biological characteristics of Clostridium perfringens alpha-toxin (CPA), the CPA251-370 gene was cloned and the 120 amino acid carboxy terminal of CPA (CPA251-370) was obtained. The secondary and three-dimensional (3D) structures of CPA251-370 were predicted. The secondary structure of CPA251-370 consisted primarily of 35.48% β-sheets and 44.35% random coils. Compared with the CPA toxin consisting of 10 α-helices and eight β-sheets, the 3D structure of CPA251-370 only contained eight β-sheets. The circular dichroism (CD) spectrum detection showed that the CD spectrum of CPA251-370 changed slightly compared with the CD spectrum of CPA. Biological activity assays showed that CPA251-370 had lost the phospholipase C (PLC) activity and haemolytic activity of CPA. More importantly, the mice immunized with CPA251-370 were protected against a challenge with 1 MLD C. perfringens type A strain C57-1. This study laid a solid foundation for explaining the relationship between molecular structure and biological characteristics of CPA in the future. Our research also provides CPA251-370 as a candidate strains for genetic engineering subunit vaccines of C. perfringens type A. 相似文献
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Enterotoxaemia in sheep due to Clostridium welchii type D was indicated by field and laboratory investigations in Nepal. Morphological, cultural, biochemical, biological and toxin-producing characteristics observed were used to type the isolates. In anaerobic meat medium, all isolates produced pinkish discoloration of meat. All the strains fermented lactose, maltose, dextrose and sucrose whereas, salicine was fermented only by 17 strains. All but five strains were MR negative. Out of 200 isolated, 166 produced both alpha and epsilon toxins and the remaining 34 non-toxogenic strains are likely to be variants which have lost their toxogenicity. Epidemiologically the local name "Six months disease" and enterotoxaemia are considered to be identical diseases. 相似文献
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Relationship between Clostridium septicum alpha-toxin activity and binding to erythrocyte membranes 总被引：1，自引：0，他引：1
Hang'ombe MB Kohda T Mukamoto M Kozaki S 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2005,67(1):69-74
The activity of Clostridium septicum alpha-toxin was determined in erythrocytes of various animals, with sensitivities observed in the order of mouse, rat, canine, equine, rabbit, chicken, bovine, swine and ovine. Temperature and protease treatment affected the sensitivity of erythrocytes to alpha-toxin. Proteinase K treatment decreased the sensitivity of murine, canine, equine and bovine erythrocytes, but ovine erythrocytes did not change the sensitivity to alpha-toxin activity. On the other hand, the activity of alpha-toxin on swine erythrocytes increased after treatment with proteinase K, trypsin, chymotrypsin or lysyl endopeptidase. Toxin overlay assay showed that alpha-toxin bound to erythrocyte membrane proteins with a molecular mass of 30 to 45-kDa in mouse, equine, bovine, swine and chicken, whereas in rat erythrocyte membranes the toxin reacted with 100-kDa protein. The treatment of murine and swine erythrocyte membranes with phosphatidylinositol-specific phospholipase C resulted in liberation of the toxin-binding protein from the individual membranes in a native state. These results show that alpha-toxin associates with specific erythrocyte membrane proteins in any animal species, and are subsets of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in various animal species. These results may reflect distinct characteristics of the hemolytic activity of alpha-toxin in response to various erythrocytes. 相似文献
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利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。 相似文献
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蛋花羊奶皮子配方及加工工艺研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过改进传统奶皮的加工工艺,研究开发出一种营养价值更加全面,外观和风味更好,更易吸收的新型鸡蛋花羊乳奶皮子。本研究以新鲜山羊奶和鸡蛋为主要原料,通过正交试验筛选出了蛋花奶皮子的最佳制作工艺以及原料配方。试验得出:(1)蛋花奶皮子最佳制作工艺:原料乳→过滤、灭菌→均质→加热翻扬搅拌(90℃,2h)→加入鸡蛋糊(2%)→轻搅混匀→保温(4-6h)→停止加热使其自然冷却(约12h)→从锅中倒出奶皮子→干燥→冷藏。(2)蛋花奶皮子最佳原料配方:新鲜羊奶98%,鸡蛋添加量2%,新鲜羊奶≥3.5 kg。研制的新型羊乳制品不仅含有人体所需的亚油酸和亚麻酸,而且还有丰富的DHA和卵磷脂,健脑益智,改善各个年龄组的记忆力,具有丰富的营养价值。 相似文献
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将重组质粒分别转化至相应的受体菌XL1-BLUE中，得到重组菌株XL1-BLUE（pHOG-2E3)。ELISA和SDS-PAGE检测表明：经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白在重组菌株XL1-BLUE（pHOG-2E3)中主要形成了包含体的形式，在其胞周质和培养上清中也检测到了ScFv的存在，经薄层扫描分析：重组菌株XL1-BLUE（pHOG-2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的4%，占菌体总蛋白的相对含量为22%，其相对分子量约为31kD。表达的SeFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性，而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生了良好的被动保护作用。 相似文献