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《中国南方果树》2021,(5)
为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。 相似文献
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应用PCR检测柑桔溃疡病，所用引物为5′TTGGTG TCGTCGCTTGTAT 3′和5′CACGGGTGCAAAAAATCT 3′。从病样的叶片、果皮和枝皮抽提溃疡病菌核酸进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，产生大约220bp的特征条带，与纯培养溃疡病菌的PCR产物一致。试验比较两种核酸抽提方法，微量快速抽提法的灵敏度明显高于高盐抽提法。有症状病样品的不同部位均能检测到溃疡病；病株的无症状叶片、果皮、枝皮有部分检测到病菌。病果园健康植株大多数检测不到病菌，少数植株PCR产物电泳条带较弱。取样量以10～20mg为宜。该PCR技术可用于快速检测柑桔溃疡病。 相似文献
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柑桔溃疡病菌的PCR检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过优化PCR反应条件,拟建立快速、特异、准确的检测柑桔溃疡病的方法。试验结果表明,25μL优化反应体系:10×PCR缓冲液2.5μL,10 mM/L dNTPs 0.5μL(终浓度为0.2 mM/L),2 U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL(终浓度为0.04 U/μL),5 mM/L引物各0.5μL(终浓度为0.1 mM/L),DNA模板1μL(终浓度为6.0×10~6cfu/mL/mL),灭菌ddH_20 19.5μL;PCR扩增退火温度为59℃;柑桔溃疡病菌病茵浓度检测下限为6.0×10~3cfu/mL,可以获得柑桔溃疡病菌的特异性片段,能够满足生产中对柑桔溃疡病检测的要求。 相似文献
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根据葡萄根癌病菌核糖体基因间隔片段(16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)特异区域设计,合成了一对引物,建立了快速检测葡萄根癌病菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果表明:只有葡萄根癌病菌能扩增出大小为758 bp的特异性条带,而非葡萄根癌病菌均未能扩增出任何条带。检测灵敏度达10个细菌/μL左右,且稳定性好,经多次反复冻融,扩增条带未发现有明显变化。通过对田间病样进行检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速(4 h左右完成检测)、灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点。 相似文献
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《中国南方果树》2016,(6)
为找出较优的单头柑桔木虱黄龙病菌核酸提取方法,以饲养于温室内感染柑桔黄龙病的甜橙树上的柑桔木虱为试材,采用3种方法提取单头柑桔木虱的总核酸,对提取的核酸样品进行质量检测,并利用柑桔黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c以及r-rplLAs/f-rplLAs分别进行了常规PCR和qPCR检测。结果表明,3种方法均可以成功提取到单头柑桔木虱总核酸且均能检测到黄龙病菌。3种方法各有优缺点:李菁的方法步骤简单、历时短,提取的核酸浓度较高,但核酸质量较低;氯仿-异戊醇法步骤较多、历时长,提取核酸浓度较低,但核酸质量较高;动物组织直接PCR试剂盒法简便快速,提取的核酸浓度高,核酸质量一般,成本较高。 相似文献
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《中国南方果树》2017,(1)
2013—2015年果实成熟采收期,先后从江西赣州18个县(市、区)115个乡镇随机采集883份脐橙果实样品进行病原菌的分离和鉴定。结果表明,发现有柑桔青霉病菌Penicillium italicum、柑桔绿霉病菌P.digitatum、柑桔扩展青霉病菌P.expansum、柑桔炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、柑桔干腐病菌Fusarium moniliforme、柑桔疫霉病菌Phytophthora citrophthora、柑桔黑腐病菌Alternaria citri、柑桔黑斑病菌Phoma citricarpa等8种病原真菌,以及柑桔溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri、柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus等2种病原细菌。其中,柑桔青霉病菌+柑桔绿霉病菌的检出率分别为40.7%,柑桔炭疽病菌的检出率为23.2%,柑桔溃疡病菌的检出率分别为7.0%,其余病原菌的检出率在0.1%~1.6%之间。赣南脐橙贮藏期,柑桔青霉病与绿霉病是重点防治对象,且要加强柑桔炭疽病的防治。 相似文献
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红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列
比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种
细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2
对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基
因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快
速可靠的检测。 相似文献
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番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。 相似文献
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采用生长速率法测定了岩白菜内酯对柑桔青霉菌、柑桔绿霉菌、柑桔炭疽病菌、柑桔褐腐病菌、褐色蒂腐病菌、柑桔黑腐病菌和柑桔黑斑病菌等7种常见柑桔病原菌的抑制活性,通过显微观察和生长量测定研究了岩白菜内酯抑制柑桔炭疽病菌的机理,采用夏橙果实贮藏试验研究了岩白菜内酯用于柑桔保鲜的效果。结果表明,岩白菜内酯能够抑制7种病原菌的生长,随着浓度的增加,抑制率增大,其中对柑桔青霉菌的抑制效果最好,EC50为0.399 6mg/L。20μg/mL岩白菜内酯处理引起柑桔炭疽菌形态发生明显变化,菌丝隔膜大部分消失,菌丝扭曲畸形,菌丝壁粗糙、不对称,分生孢子畸形;菌丝生长受到明显抑制,第3天时抑制率达61.74%,随后抑制作用迅速减弱,第6天时仅2.31%。0.006g/mL岩白菜粗提物对通风库贮藏90天夏橙的青霉病的防治效果达到100%;贮藏60天的总防治效果为50%,好于450g/L咪鲜胺水乳剂1 500倍液(27.27%)。岩白菜内酯抑菌作用很好,可作为柑桔保鲜剂进行开发利用。 相似文献
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《果树学报》2019,(12)
【目的】西瓜枯萎病是一种严重危害西瓜生产的世界性土传真菌病害,快速及时地检测出西瓜枯萎病菌,对西瓜枯萎病的早期监控预测及后期防治具有重要意义。【方法】利用镰孢属尖孢镰刀菌基因组的数据库,设计筛选西瓜枯萎病菌的特异引物,基于普通PCR技术建立快速简便的分子检测体系,对接种过的西瓜植株和土壤进行检测验证。【结果】该引物可获得556 bp的特异性扩增片段,体系的灵敏度为365 pg·μL~(-1)。利用PCR检测体系对感病西瓜植株和土壤进行检测,结果显示在抗感品种接种1～5 d后都能检测到西瓜枯萎病菌,而此时植株没有病症,后期检测到的病菌量与其病情指数有一定的相关性;检测接种过的土壤的灵敏度为5×102cfu·g~(-1),而在此密度的病菌土壤中,西瓜植株的发病株率较低。【结论】建立了一套基于普通PCR技术分子检测体系,可用于感病植株和土壤的西瓜枯萎病菌快速及时检测,为指导西瓜枯萎病的早期预测以及制定综合防治措施提供重要的参考依据。 相似文献
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杂柑‘W·默科特’黄龙病菌分子鉴定和遗传多样性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《园艺学报》2019,(6)
2017年12月在云南红河新引种的‘W·默科特’杂柑植株上发现疑似黄龙病的叶片斑驳及"红鼻子果"症状。采集疑似的叶片和果实,分别提取其叶片中脉和橘络的DNA,利用黄龙病菌的特异引物对其16S rRNA基因和β–操纵子基因进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序分析。研究结果表明,采自云南的‘W·默科特’样品中PCR能够扩增出黄龙病菌的特异条带,通过上述基因进行系统发育分析,发现该病菌归属于黄龙病菌亚洲种;为了进一步探明这些黄龙病菌的遗传多样性,利用3种类型的原噬菌体特异性引物对样品进行扩增分析,结果表明采自云南的‘W·默科特’植株上的黄龙病菌遗传多样性较为丰富。 相似文献
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【目的】杧果露水斑病是当前生产上影响杧果产业的重要病害之一,因潜伏期长常在发病初期不易被察觉而错过防治适期,建立其主要致病菌Cladosporium cladosporioides的快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控尤为重要。【方法】将该病菌的ITS序列与NCBI中的数据大量比对后,在差异位点大的区域设计了8对引物,通过筛选获得两对特异性良好的引物及其扩增条件。【结果】两对特异性引物分别是ML-SF9/ML-SR5和ML-SF10/ML-SR10,扩增条件:94℃4 min;94℃45 s,65℃45 s,72℃1 min,36周;72℃10 min,特异条带大小分别为408 bp和424 bp。为了提高检测的灵敏度,又与真菌通用引物ITS1/ITS4结合后,建立了杧果露水斑病病原菌的两套巢式PCR快速检测体系,可检测病菌DNA的含量最低为3.55×10-9ng·μL-1,比常规PCR灵敏度提高了1万倍,且能实现对潜伏期果实的特异性检测。【结论】此技术操作简单、特异性强、灵敏度高,为杧果露水斑病的早期诊断提供了新方法。 相似文献
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柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。 相似文献
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以杏鲍菇枯萎病菌侧耳泛菌(Pantoea pleuroti)为试材,采用PCR引物设计的方法,通过分析P.pleuroti基因组的测序结果,设计合成并筛选出可检测P.pleuroti的引物,并研究其检测效果,以期建立P.pleuroti的高效PCR检测体系,并为科学防控杏鲍菇枯萎病提供分子基础。结果表明:K3143F/R和K37F/R 2对引物特异性强,仅P.pleuroti基因组DNA作为模板时,PCR扩增产物分别呈现1条660 bp和1条666 bp的特异性条带,15株Pantoea属细菌和3株食用菌常见病原菌的基因组DNA及阴性对照作为模板扩增产物均无条带;基于这2对引物建立的检测体系均不受杏鲍菇组织液的干扰,灵敏度高,可检测出最低3.6 pg·μL-1的P.pleuroti基因组DNA;应用这2种体系对接种P.pleuroti 48 h后的杏鲍菇样品进行了检测,最低可检测出子实体内100 cfu的杏鲍菇枯萎病菌;此外,整体上,引物K3143F/R比K37F/R的检测效率更高。 相似文献