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香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备 总被引：1，自引：1，他引：0
用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。 相似文献
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应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。 相似文献
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以威廉斯8818香蕉为试材,采用整株挖掘、分解取样的方法,研究其干物质的构成特点、各器官矿质元素含量和累积及分布特征。结果表明,香蕉植株果实膨大期总干物质量为5.4 kg/株,其中叶片占36.1%,假茎占34.3%,球茎占15.1%,果实占10.6%,根占2.9%,果轴占1.1%。每株累积吸收N 61.65 g、P 4.40 g、K 49.65 g,N、P、K的吸收比例为1∶0.07∶0.81。此时期,N、P、K分配率规律为叶片＞假茎＞果实,果轴中则最低。叶片中N含量最高,其次为果实和果轴,假茎(叶鞘)最低。P以果实含量最高,叶片次之,球茎最低。K以果实含量最高,根次之,假茎(叶鞘)和球茎最低。叶片、假茎(叶鞘)、真茎(地上茎)和球茎中各矿质元素含量的大小顺序为N＞K＞P,而果实、果轴和根中则为K＞N＞P。 相似文献
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柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。 相似文献
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香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产.BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究.本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备.结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3h.融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清.Western blot实验表明抗血清具有特异性; 酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954 μg/mL浓度的表达纯化蛋白. 相似文献
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用含质粒pYF8631的根癌农杆菌EHA105菌株转化‘巴西’香蕉(Musa AAA Cavendish subgroup cv.‘Brazil’)的假茎横切薄片,在含有250 mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS培养基上诱导不定芽,获得5株GUS阳性苗。经PCR、RT-PCR检测,发现其中2株可以合成ALAS mRNA,表明YHem1基因已经整合到基因组中并且能够正常表达。测定香蕉内源ALA含量、ALAS活性和叶绿素相对含量(SPAD)表明,转基因植株具有ALAS活性,其ALA含量和叶绿素含量均显著高于野生型对照。7℃低温处理后的叶绿素快速诱导荧光动力曲线测定表明,转基因香蕉叶片光合电子转换能力显著高于野生型,表明转化YHem1基因可以提高香蕉耐冷性。 相似文献
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茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为103~108拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。 相似文献
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基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量 PCR(real time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重 SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86. 相似文献
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稻水象甲卵巢内β1-微管蛋白基因cDNA全长的克隆及定量表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别对中国的孤雌生殖型和美国的两性生殖型稻水象甲卵巢内β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长分别为1727bp和1730bp,均包含1344bp的完整开放阅读框(ORF),编码447个氨基酸,理论分子量约50kD,等电点4.54。同源性分析表明,克隆的β1-微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,相似性介于95%～100%。荧光定量PCR分析表明,β1-微管蛋白在孤雌生殖型稻水象甲卵巢内的表达量(3.14×107copies/μL±0.66×107copies/μL)显著高于两性生殖型稻水象甲(5.08×106copies/μL±0.47×106copies/μL)。推测该基因的差异表达对于稻水象甲孤雌生殖过程中纺锤体的组装具有重要意义。 相似文献
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为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求. 相似文献
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分析我国香蕉生产的机械化现状,探讨我国需要解决的香蕉生产机械化技术问题。针对我国香蕉生产的种植模式和劳动力状况,提出我国香蕉生产应尽快研发的机具。 相似文献
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以香蕉MuMADS1为诱饵载体,采后2 d的香蕉果实的cDNA文库为猎物,采用酵母双杂交的方法得到了泛素激活酶E1的基因片段,命名为MuUBA。采用双分子荧光互补技术进一步验证MuMADS1与MuUBA在植物体内的相互作用。荧光实时定量PCR结果表明,MuMADS1和MuUBA在香蕉中子房发育第4个阶段的表达量最高,但是在茎中的表达量很低,表明其在不同的组织和发育的果实中的表达具有协同性。MuMADS1和MuUBA的表达都受外源乙烯和1-MCP的高度调控,推测MuMADS1和MuUBA在香蕉果实的采后成熟过程中具有很重要的作用。 相似文献
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香蕉茎尖遗传转化法研究 总被引：20，自引：2，他引：18
通过对多茎尖繁殖方法和转基因研究,建立了香蕉茎尖外源基因的遗传转化方法。明确了卡那霉素或Ｇ－４１８在转化植株中所使用的合适浓度,即当使用卡那霉素时,其产梢的浓度为１００ｍｇ／Ｌ,导根的浓度为１５０ｍｇ／Ｌ;但当使用Ｇ－４１８时,其产梢浓度则为２５ｍｇ／Ｌ其导根浓度则为３０ｍｇ／Ｌ或３５ｍｇ／Ｌ。通过基因枪和农杆菌共培养法尝试将黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因转化香蕉组织,其结果表明：经过卡那霉素或Ｇ－４１８的筛选,仅有５％～７％的芽能够存活下来。通过选择性继代培养,最后获得了７３株株转化植株;对其中的２４株进行ＰＣＲ检测,结果表明阳性率达８３．３％;进一步的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明：ＰＣＲ检测阳性的８１．８％植株含有外源衣壳蛋白基因。 相似文献