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1.
SYBR Green Ⅰ实时PCR技术鉴定鸭源性成分的研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法.结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区分特异性产物,检测灵敏度可达到1 pgDNA.同时利用该方法可检测出熟牛肉、鸭肉混合样品中的鸭肉成分.SYBR Green Ⅰ实时PCR方法能快速、特异、灵敏的检测鸭肉成分. 相似文献
2.
水貂绿脓杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为了利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立水貂绿脓杆菌核酸快速检测方法。根据绿脓杆菌外毒素A基因240 bp片段保守序列设计一套LAMP特异性引物,对水貂绿脓杆菌基因组DNA进行LAMP扩增,通过浑浊度、SYBR Green荧光染料显色及电泳观察结果,并进行特异性和敏感性检验。结果表明：完成反应仅需要60 min(65℃),特异性强,最低检测限为1 ng/μL。该方法简单快捷、特异性强、灵敏度高,适合于基层使用,具有广泛的临床应用前景。 相似文献
3.
SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1 总被引：3，自引：0，他引：3
该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台. 相似文献
4.
动物源性食品中猪源性成分检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为探讨猪源性成分检测可行的方法,利用SYBR Green I Real time PCR对动物源性食品中猪源性成分进行测定。根据猪mtDNA保守序列设计特异性引物,对牛、羊、猪的动物源性食品进行扩增;克隆目的基因片段,并以此为标准品,优化反应条件和反应体系,提高灵敏度;反复检测不同样品,测试稳定性。结果表明SYBR Green I Real time PCR技术能够特异性的检测到动物源性食品中猪源性成分,引物特异性强、稳定性可靠,灵敏度达到1×10-6 ng/μL,建立了动物源性食品中猪源性成分的快速、精准、经济、便捷的检测方法。 相似文献
5.
《华北农学报》2017,(Z1)
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。 相似文献
6.
巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR技术,检测转基因大豆外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS)。结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1%的大豆中的CaMV35S基因,而第一轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL。同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分。巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限,SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分。 相似文献
7.
菌落聚合酶链反应检测支气管败血波氏杆菌 总被引：1，自引：1，他引：0
根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica) 鞭毛蛋白基因的上游序列设计1对引物Fla1和Fla2,采用菌落PCR方法扩增目的基因片段来检测支气管败血波氏杆菌。利用该方法成功的从8株支气管败血波氏杆菌中扩增出237 bp左右的特异性目的片段。特异性试验表明,该方法对大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌均无交叉性反应。灵敏性试验表明,将单个菌落稀释105倍利用此菌落PCR仍能扩增到相应的目的片段。结果表明建立的菌落PCR方法对支气管败血波氏杆菌的检测敏感性高、特异性强,可用于Bb感染的诊断和流行病学调查。 相似文献
8.
为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green I实时PCR技术,检测转基因大豆 外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS).结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1％ 的大豆中 的CaMV35S基因,而轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的 特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解 曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL.同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分.巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限, SYBR Green I实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分. 相似文献
9.
《华北农学报》2016,(Z1)
为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法,以副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的特异性单克隆抗体1E2作为捕获抗体,兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体,通过方阵滴定优化夹心ELISA检测方法最佳反应条件,并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示,该检测方法中单克隆抗体1E2最佳包被浓度为3.434μg/m L,兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为3.350μg/m L,用10 mg/m L明胶37℃封闭1 h优于其他封闭液,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为1∶4 000。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出15个血清型的副猪嗜血杆菌病原,而与其他病原菌的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示该方法能够检测出副猪嗜血杆菌的最低菌落浓度为1×106cfu/m L。利用该检测方法对临床115份副猪嗜血杆菌可疑病料进行检测结果显示可检出83份阳性样品,检出的阳性样品数高于细菌分离及PCR鉴定方法。上述结果表明所建立的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法特异性强、敏感性好并可应用到临床样品的检测。 相似文献
10.
本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。 相似文献
11.
马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 -6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。 相似文献
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LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用 总被引：4，自引：1，他引：3
以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测. 相似文献
13.
转基因抗虫玉米的定量检测 总被引：1，自引：1，他引：0
建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。 相似文献
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为寻找一种能广泛应用于食品检验、临床诊断的快速、简便、灵敏度高、特异性较好、价格低廉的肠出血性大肠杆菌（VTEC）的检测方法;对VTEC致病相关基因VT1和VT2基因序列进行分析,并设计2对特异引物,通过SYBR GreenⅠ多重荧光PCR反应法结合熔链曲线分析,实现对VTEC的检测;结果表明该方法具有较高的灵敏度及特异性,能够对肠出血性大肠杆菌（VTEC）进行有效检测,其最低检出限可达10cfu/g。利用该技术检测VTEC,具有快速、方便、准确、高效的特点,是一种适于检验检疫和兽医临床检验等领域的快速检测的有效方法。 相似文献
16.
猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 相似文献
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叶用莴苣荧光定量PCR体系的优化 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立一套最适合叶用莴苣(Lactuca sativa L.)基因表达量研究的荧光定量PCR技术体系,以叶用莴苣S24为试材,采用SYBR GreenⅠ法,利用叶用莴苣内参基因的2对引物组合18SR1和18SR2,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下进行扩增反应。结果表明,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下内参基因引物组合18SR1的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标都优于内参基因引物组合18SR2;2对内参基因引物组合18SR1和18SR2在10 μL反应体系中的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标也均优于20 μL反应体系。因此叶用莴苣荧光定量PCR内参基因利用18SR1引物组合,反应体系采用10 μL比较合理。 相似文献