共查询到10条相似文献，搜索用时 15 毫秒
1.
在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达. 相似文献
2.
提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性. 相似文献
3.
【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。 相似文献
4.
大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的原核表达、纯化及其活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
使用常规PCR法以大肠杆菌菌株ATCC 25922基因组为模板,克隆到该菌株的碱性磷酸酶成熟肽基因,并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)的Bam HⅠ、XhoⅠ之间,获得重组表达载体pET-30a-EAP。并且我们将pET-30a-EAP转化到大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达后,获得大小为52ku的目的蛋白EAP。经试验证明该蛋白以可溶形式为主。进而,高效表达的重组碱性磷酸酶经亲和层析法纯化后被用于活性鉴定。pNPP的显色反应与去磷酸化试验证实来自ATCC 25922的重组碱性磷酸酶具有催化磷酸单酯水解活性,而且酶热稳定性高、有效工作温度范围大,与其他蛋白融合表达时仍保持酶活性。以上研究结果为大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的规模化生产及在免疫酶技术领域中的应用提供了重要的参考依据。 相似文献
5.
弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中弓形虫表面抗原SAG3基因序列,以弓形虫总RNA反转录的cDNA为模板,扩增出SAG3去除信号肽基因并进行原核表达.将重组pET-28a(+ )-SAG3阳性表达质粒转入大肠杆菌BL(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.通过SDS- PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果表明:成功扩增了不合信号肽的SAG3基因,构建的原核表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,能够与鼠抗弓形虫阳性血清发生特异性反应,去信号肽的SAG蛋白具有反应原性. 相似文献
6.
7.
将orf216基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-orf216,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys菌株感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。通过Ni-NTA亲和层析系统纯化获得高纯度目的蛋白。研究结果表明,成功构建了pET-30a(+)-orf216原核表达载体并转化大肠杆菌。SDS-PAGE和Western Blot结果显示30 ku处有单一条带,确定其能高效表达并且诱导表达产物为ORF216蛋白。同时对利用Ni-NTA层析系统纯化高纯度高含量ORF216融合蛋白的条件进行了优化。 相似文献
8.
为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍. 相似文献
9.
[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。 相似文献
10.
为了筛选出高表达棉花GhWRKY91可溶性蛋白的原核表达载体。以中棉所10号叶片的cDNA为模板PCR扩增GhWRKY91基因,扩增产物分别构建到4个不同的原核表达载体pET-22b(+)、pET-32a(+)、pMAL-c5x和pGEX-4T-1。将重组载体pET-22b(+)-GhWRKY91、pET-32a(+)-GhWRKY91、pMAL-c5x-GhWRKY91和pGEX-4T-1-GhWRKY91转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)或Arctic-Express?(DE3)RP中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析不同原核表达载体的蛋白表达情况。结果显示,pET-22b(+)-GhWRKY91 和pET-32a(+)-GhWRKY91在BL21(DE3)中以及pMAL-c5x-GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中均未见明显蛋白表达,而pGEX-4T-1- GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中表达的蛋白基本存在于上清中,可获得可溶性蛋白。因此,将GhWRKY91基因构建到pGEX-4T-1原核表达载体上可成功获得可溶性蛋白。 相似文献