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1.
《中国预防兽医学报》2019,(8)
为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,初步建立了SVA的间接ELISA抗体检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测;利用该方法对43份背景清晰的猪血清进行检测,并与中和试验结果进行比较;同时对205份临床猪血清样品进行检测。结果显示,本研究正确表达了约51.0 ku的可溶性重组蛋白,western blot试验表明纯化的r VP1蛋白具有良好的反应原性,以r VP1蛋白建立了间接ELISA方法。特异性试验结果显示该ELISA方法可以检测SVA抗体,而与FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、PRRSV、PRV等病原的抗血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示样品经1∶800倍稀释后折OD450nm值仍大于临界值;批内、批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床猪血清样品的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段。 相似文献
2.
为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10 000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为... 相似文献
3.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(18)
为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。 相似文献
4.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
5.
利用纯化的猪细小病毒VP2蛋白为抗原,建立检测猪细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA。最佳反应条件为:抗原包被浓度300 ng/孔,4℃过夜,待检测血清1:50稀释。与猪细小病毒病阳性血清呈阳性反应,与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪日本脑炎和猪圆环病毒病等5种疾病的阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数均小于10%。用该方法与Ceditest PPV猪细小病毒抗体检测试剂盒对102份血清进行平行检测和比较,间接VP2-ELISA的敏感性为93.8%,特异性为81.1%,符合率为89.2%。结果表明,猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪细小病毒感染的血清抗体检测。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2020,(1):42-48
为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2015,(10)
为建立检测猪细小病毒3型(PPV3)的间接ELISA方法,本研究选取PPV3 VP2多表位亲水区序列设计引物,扩增并原核表达该基因片段,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了PPV3间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该检测方法仅对PPV3血清检测为阳性,与PPV1、PPV2、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒等的标准阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。本研究为临床上PPV3的检测提供了血清学检测手段。 相似文献
8.
《畜牧与兽医》2014,(11):60-64
为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。 相似文献
9.
为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2020,(4)
为了建立塞内卡病毒A(SVA)血清学诊断方法,本研究体外融合表达结构蛋白VP2和VP3全长,并建立了间接ELISA方法,并利用建立的方法,进一步研究了多次感染SVA后VP2/3抗体的消长规律。本研究首先从塞内卡GD01/2017株中扩增出VP2和VP3基因,将其克隆至表达载体pET-30a,IPTG诱导表达目的蛋白,经检测蛋白以包涵体形式存在。大量诱导表达后收集纯化包涵体蛋白,用6 mol/L盐酸胍溶解包涵体并测定其浓度为5.3 mg/mL,利用该蛋白建立了SVA结构蛋白VP2/3的间接ELISA检测方法。本研究进一步利用该ELISA方法检测SVA GD01/2017株多次感染SPF猪后的血清样品,绘制了VP2/3抗体的消长规律图,为后续疫苗免疫程序的制定奠定基础。 相似文献
11.
12.
旨在通过乳头灌注脂多糖(LPS)体外模拟奶牛急性乳腺炎,研究奶牛乳腺组织及机体免疫活化状态。选用4头泌乳后期的荷斯坦奶牛16个乳区为研究对象,采用交叉试验设计,每期试验2 d,试验间隔10 d,试验组乳头管乳头灌注LPS 0. 1 mg,对照组乳头管灌注等量生理盐水。结果:试验组灌注LPS后,奶牛体温值和乳汁中体细胞数随时间变化而逐渐升高,而奶牛血液中白细胞数随时间变化而逐渐降低;乳腺组织的腺泡腔内充斥大量炎性细胞,部分腺泡组织萎缩甚至崩塌;试验组灌注LPS 12 h后奶牛血清中的髓过氧化物(MPO)活性极显著下降(P<0. 01),而乳腺组织中的MPO活性则极显著上升(P<0. 01);奶牛血清及乳清中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的蛋白含量明显上升(P<0. 01);乳腺组织中Toll样受体4 (TLR4)、核因子NF-κB (p65)蛋白的表达量相比对照组极显著上升(P<0. 01)。研究表明,LPS能够诱导奶牛发生乳腺炎,使乳腺组织发生损伤,并激活机体的TLR4/NF-κB信号通路进而促进其下游炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因的表达,使机体发生免疫应答。 相似文献
13.
塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从中筛选出最佳扩增引物,通过对引物浓度、退火温度、延长时间、循环次数进行优化,成功建立了SVA的RT-PCR检测方法。用该方法检测SVA、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应,具有良好的特异性。敏感性试验结果显示,病毒检测限可达1TCID50,比国外文献报道的检测方法灵敏性更高。用该方法检测山东省的100份猪组织样品,阳性率为2%。本研究所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,为SVA的快速检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。 相似文献
14.
冬季猪舍内温湿度与有害气体分布规律研究 总被引：2，自引：0，他引：2
本试验旨在研究冬季不同类型猪舍(妊娠舍、分娩舍和保育舍)内温度、相对湿度、风速、氨气(NH3)和二氧化碳(CO2)浓度的变化规律、分布情况及其影响因素,为完善猪场的环境调控措施提供理论依据。本试验采用1412型光声多点气体检测仪,RC-4HC温湿度计以及Testo425型风速仪,分别监测猪舍内的NH3和CO2、温湿度和风速的动态变化。监测高度设在距离地面0.8m和1.5m处,每日间隔2小时监测1次,连续监测3d。结果显示:分娩舍内的温湿度最高,其次为保育舍,妊娠舍最低;而风速则相反,妊娠舍内风速最高,其次为保育舍,分娩舍最低;妊娠舍、分娩舍和保育舍内的NH3浓度范围分别为9.16~11.17mg/m^3,9.52~10.79mg/m^3和8.08~8.31mg/m^3;CO2浓度范围分别为2687~4107mg/m^3,3084~3792mg/m^3,1654~2233mg/m^3;通过三个舍内环境因子的相关性分析,温度、湿度、NH3与CO2彼此间显著相关。研究表明NH3浓度水平表现为分娩舍>妊娠舍>保育舍>舍外,四者均未超过国家标准(20mg/m^3)。CO2浓度水平表现为分娩舍>妊娠舍>保育舍>舍外,三种类型猪舍浓度均超过国家标准(1500mg/m^3)。 相似文献
15.
为了探讨槲皮素对鸡小肠P-糖蛋白(P-gp)转运功能的影响,选用槲皮素(10和50μmol/L)处理MDCK-ch Abcb1细胞系后分别进行美托洛尔和伊维菌素的双向转运试验;采用不同剂量的槲皮素(15和60 mg/kg)连续灌流5或10 d后进行美托洛尔的原位灌流试验,用60 mg/kg槲皮素处理试验组鸡10 d后进行伊维菌素的灌流试验。结果显示:10和50μmol/L槲皮素均能显著(P<0. 05)增强MDCK-chAbcb1细胞对美托洛尔的外排作用,外排率可从1. 89分别增至2. 95和2. 36,但均对MDCK细胞无显著影响(P>0. 05);灌流试验结果显示不同浓度的槲皮素均极显著降低美托洛尔的小肠有效渗透率(Peff)(P<0. 01),尤其低浓度槲皮素的作用更为显著; 60 mg/kg的槲皮素处理组虽能降低P-gp底物伊维菌素的Peff,但与对照组相比,差异不显著(P>0. 05)。结果表明:槲皮素在一定程度上会影响鸡P-gp的外排转运功能,在畜牧生产中使用时应注意考虑药物-饲料间相互作用,避免其对底物药物的体内过程产生影响。该结果可为临床制定合理的用药策略提供理论基础。 相似文献
16.
本研究采用配对试验设计,选择年龄、胎次、产奶量、泌乳天数相近的荷斯坦牛30头,随机分成两组,每组15头,对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮基础上饲喂复合霉菌毒素吸附剂20g/(头·d),其他饲养管理方式不变。预饲期7d,正试期63d,分别测定产奶量、乳成分、血液生化指标、抗氧化能力及免疫调节功能指标。结果表明,饲粮中添加复合霉菌毒素吸附剂对奶牛产奶量及乳成分无显著影响(P>0.05),试验组较对照组乳中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素分别降低了13.36%(P<0.05)、8.64%(P<0.05)、3.75%(P>0.05),血清中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素分别降低20%(P<0.05)、14.62%(P<0.05)、13.88%(P<0.05)。两组血液生化指标及抗氧化指标差异不显著(P>0.05),试验组的IL-1、IL-6水平低于对照组,但差异不显著(P>0.05),TNF-α含量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果提示在不影响泌乳牛正常生产性能情况下,使用复合霉菌毒素吸附剂可以降低奶牛体内及乳中霉菌毒素的残留。 相似文献
17.
温和噬菌体P88由溶原性大肠杆菌K88诱导得来,前期研究结果表明其尾丝蛋白的716-746位氨基酸为其受体识别的关键区域。本研究旨在确定该关键区域内的关键氨基酸位点。采用大肠杆菌无痕缺失的方法以溶源大肠杆菌K88的基因组为操作对象,将P88尾丝蛋白中的第716、719、721、722、725、730、734、736、744和746位的氨基酸分别定点突变为丙氨酸,丝裂霉素C诱导定点突变溶原菌K88,之后用P88的宿主菌DE048筛选和纯化定点突变噬菌体,并测定定点突变噬菌体宿主谱。在构建的10株大肠杆菌K88定点突变株中,有5株可以诱导出与亲本噬菌体P88具有相同宿主谱的噬菌体突变株,然而尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸定点突变的K88突变株无法用DE048筛选出突变噬菌体粒子,因此推测噬菌体尾丝蛋白第719、721、730、734和736位氨基酸为其受体识别的关键氨基酸位点。本研究为温和噬菌体基因和宿主谱的改造提供了理论基础。 相似文献
18.
为保存江苏地方猪种的种质资源,通过采集猪耳结合低温运输进行老年猪耳组织块贴壁培养,建立猪耳成纤维细胞,进而将细胞扩繁传代并冷冻保存。通过规范采样流程,结合低温运输方式,使运输时间达到8h以上,扩大了采样范围,同时,使污染风险由前期的30.77%(13头)降低到目前的8.3%(12头)。虽然老年猪耳成纤维细胞在初期游离到铺满培养瓶需要21d,远高于胎儿(怀孕24d的胚胎)成纤维细胞,但其后期的冻存与解冻培养均不受影响。随后,利用手工克隆技术生产克隆胚胎,老年猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(27.04±4.08)%与新生猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(28.8±2.37)%相比,无显著差异(P>0.05)。本试验结果证明老年猪耳成纤维细胞培养及冻存的可行性,为利用体细胞与体细胞核移植对地方猪种种质资源的保存提供支持。 相似文献
19.
猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。 相似文献