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荧光实时定量PCR技术是近年来快速发展起来的一门新技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能较准确定量等特点。本文综述了荧光实时定量PCR技术的基本原理及几种广泛应用的荧光化学方法,并概述了荧光实时定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状,并对荧光实时定量PCR技术的应用前景进行了展望。 相似文献
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实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有范围宽、敏感性高、精确度高等优点,是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,其应用领域越来越广泛。研究表明,应用实时荧光定量PCR技术,可以快速、准确、特异性地对猪链球菌2型、炭疽杆菌、空肠弯曲菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、弓形虫等细菌、病毒性病原及食品微生物进行检测、鉴定;可以用于食源性微生物、食品过敏源、转基因食品、乳品等检测。荧光定量PCR技术也可用于肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。 相似文献
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为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用 总被引：3，自引：0，他引：3
草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。 相似文献
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RT-FQ-PCR技术是一种最新PCR技术,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,在畜牧兽医中已得到了广泛的应用,虽然该技术目前仍存有许多有待解决的问题,但因其所具有的独特优势,必定会在生命科学领域得到更广泛的应用。该文就RT-FQ-PCR概念、原理、方法、应用、存在问题及应用前景等作了综述。 相似文献
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根据GenBank中(鱼师)鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测(鱼师)鱼诺卡氏菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10-6 μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性.应用建立的方法在(鱼师)鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果100％相符.既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值.结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于鱼类致病(鱼师)鱼诺卡氏菌的快速检测. 相似文献
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本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍.在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR (R2=0.994)和qPCR (R2=0.994)均表现出良好的线性关系,且2种检测方法间的定量值呈正相关(R2=0.989).在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时,qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍.ddPCR的组内和组间重复变异系数(CV)分别为0.59％-11.26％和6.55％-23.21％,而qPCR为16.57％-27.56％和22.31％-56.73％,说明ddPCR具有更好的稳定性.在临床样品定量检测时,ddPCR的检出率稍高于qPCR.本研究建立的ddPCR能够准确定量检测CyHV-2,将为CyHV-2相关研究提供有益参考. 相似文献