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1.
为获得H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(McAb),选取A/swine/NanChang/H1N1/2009毒株,病毒经增殖、超速离心后,收集病毒粒子作为免疫原,将SIV粒子包被建立了间接ELISA方法。将免疫4次的BALB/c小鼠,经间接ELISA测定小鼠血清效价,将效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(sp2/0)进行融合。采用间接ELISA的方法筛选效价高的阳性细胞孔,采用有限稀释法进行3轮亚克隆,得到了5株杂交瘤细胞株,分别命名为2C6、5G5、1D5、3G3、4F11。随后对5株杂交瘤细胞的亚型进行鉴定,显示2C6、1D5、4F11为IgM亚型,5G5、3G3为IgG1亚型,5株杂交瘤的L链均为k链。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测表明,5G5能够与HA蛋白发生特异性的结合。本研究为进一步建立H1亚型SIV的相关检测方法及对HA蛋白的功能研究奠定基础。 相似文献
2.
为了制备抗欧亚类禽型(Eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行检测,利用SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11)增殖、纯化的全病毒蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,采用间接ELISA和HI检测方法进行筛选。结果获得了两株能稳定分泌抗HA蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2B6和4C7;两株MAbs的腹水ELISA和HI效价均分别高于1∶107和5log2;两株MAbs能够在IFA试验中与病毒HA蛋白发生反应,而在Western blot试验中不能检测到病毒HA蛋白;病毒中和试验结果显示这两株MAbs对EA H1N1SIV具有病毒中和活性;MAbs的抗病毒活性又进一步通过小鼠的感染试验进行了评估,结果表明接种了MAbs的小鼠获得了有效抵抗同源及异源H1N1SIV感染的保护效果。研究证实制备的两株MAbs具有较高的病毒中和活性和较强的抗病毒感染能力,可以将其进一步应用于抗EA H1N1SIV的感染及开展病毒抗原性变异的分子基础研究。 相似文献
3.
利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年～2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%～99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以10~6EID_(50)SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log_(10)EID_(50)/mL、4.8 Log_(10)EID_(50)/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。 相似文献
5.
以禽流感H5亚型病毒分别免疫BABL／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA检测细胞上清液，结果获得了3株抗禽流感H5亚型病毒特异性单克隆抗体，分别命名为186，1D4，7D1；其中1D4株为抗禽流感H5亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株．186株和7D1株为针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体细胞株。经3次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒抗体的能力。这些单克隆抗体小鼠腹水ELISA效价为10^5，HI效价为2^11-12。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与相应的禽流感病毒株发生特异性反应，而不与鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、鹅副粘病毒等反应。所有这些单抗在禽流感诊断中将发挥重要作用。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2020,(3)
为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌抗H1N1 SIV HA蛋白的MAb杂交瘤细胞株(10H8)。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG2a。MAb 10H8细胞上清和腹水的IPMA效价分别为11 024和151 200,腹水血凝抑制(HI)效价为13log2。Western blot试验结果显示MAb 10H8能够特异性地结合HA蛋白。病毒中和试验结果显示MAb 10H8杂交瘤细胞培养上清原液和1640稀释的腹水均能够抑制H1N1亚型SIV感染细胞,对SIV具有较强的中和活性。HA蛋白合成多肽的dot-blot鉴定结果显示,MAb 10H8识别的线性抗原表位为295KCQTPHGALKGNLPFQ310。本研究为H1N1亚型SIV诊断试剂和新型疫苗研发奠定了基础。 相似文献
7.
广东部分地区H1和H3亚型猪流感抗体监测和病毒分离 总被引：2，自引：0，他引：2
从广东省17个未免疫猪流感病毒(SIV)疫苗的规模化猪场和3个肉联厂的待屠宰猪群中采集2 155份血清样品,采用ELISA方法进行猪流感的血清学调查。结果发现,种猪和肉猪H1亚型猪流感抗体阳性率分别为39.6%(329/830)和37.6%(498/1325),H3亚型抗体阳性率分别为10.8%(90/830)和4.6%(61/1325),H1+H3阳性率分别为5.2%(43/830)和1.8%(25/1325)。从281份猪鼻拭样品和肺样品中分离并鉴定出5株猪流感病毒,其中H1N1亚型3株,H3N2亚型和H1N2亚型各1株。 相似文献
8.
9.
为了了解抗H9N2禽流感病毒(AIV)单克隆抗体的确切用途,试验用纯化后的H9N2禽流感病毒免疫Balb/c小鼠,经细胞融合后再进行筛选。结果表明:获得2株能够稳定分泌抗H9N2 AIV的杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和3D6,2株单克隆抗体的腹水效价分别为1∶25 600和1∶12 800;应用间接ELISA和间接免疫荧光检测显示,2株单克隆抗体均能与H9N2亚型AIV发生反应;进一步研究发现,3D6可以与H9N2 AIV中的NP蛋白结合,使得表达NP蛋白的MDCK细胞显现出绿色荧光。说明3D6是一株针对H9N2 AIV NP蛋白的单克隆抗体。 相似文献
10.
为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。 相似文献
11.
为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。 相似文献
12.
本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。 相似文献
13.
猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 相似文献
14.
A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 106 dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method. 相似文献
15.
V.R. Monger J.A. Stegeman G. Koop K. Dukpa T. Tenzin W.L.A. Loeffen 《Preventive veterinary medicine》2014
A cross-sectional serological study was conducted in Bhutan between October 2011 and February 2012 to determine the prevalence of antibodies to classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), porcine circovirus type 2 (PCV2), swine influenza virus (SIV) subtype H1N1 and Aujeszky's disease virus (ADV). Furthermore, risk factors for the seropositive status were investigated. 相似文献
16.
WANG Bo WANG Hui-yu ZHAO Bao-hua LUO Jing WANG Cheng-min HE Hong-xuan HAN Xue-qing 《中国畜牧兽医》2017,44(10):3035-3041
To establish a rapid, accurate method to diagnose and detect H1 and H3 subtype swine influenza viruses (SIV) at the same time, the specific primers and TaqMan probes were designed according to the conserved region of the HA gene of H1 and H3 subtype SIV. A duplex Real-time RT-PCR assay was developed for detection of H1 and H3 subtype SIV. The results showed that the Real-time RT-PCR could detect 102 copies/μL of H1 and H3 subtype SIV, the sensibility was well. Coefficient of variation of Ct value between repeating groups were all below 5%, the repeatability was favorable. The results were negative for the detection of H4, H5, H7, H9 subtypes SIV, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, foot and disease virus and pseudorabies virus, the specificity was fine. One sample was H1 subtype SIV, and one sample was H3 subtype SIV, by the established assay, the positive rate was 1.16%. The method was highly accurate, rapid, sensitive and specific, and could provide a method for rapid detection and epidemiological investigation of H1 and H3 subtype SIV. 相似文献
17.
为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒（swine influence virus,SIV）的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素（hemagglutinin,HA）基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 相似文献
18.
试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到106倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。 相似文献
19.
Fusion of C3d with hemagglutinin enhances protective immunity against swine influenza virus 总被引：3，自引：0，他引：3
Guo-Xin Li Zhi-Jun Tian Hai Yu Yuan-Yuan Jin Shao-Hua Hou Yan-Jun Zhou Tian-Qiang Liu Shou-Ping Hu Guang-Zhi Tong 《Research in veterinary science》2009,86(3):406-413
H1N1 and H3N2 are the dominant subtypes causing swine influenza in China and other countries. It is important to develop effective vaccines against both H1N1 and H3N2 subtypes of swine influenza virus (SIV). We examined the effects of a DNA vaccine expressing an influenza HA fused to three copies of murine complement C3d in mice. Plasmids encoding soluble HA (sHA), complete HA (tmHA), or a soluble fused form of HA (sHA-mC3d3) were constructed from the H3N2 subtype of SIV. The immune response was monitored by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hemagglutination inhibition (HI) assays, and virus neutralization tests. Analysis of antibody titers indicated that immunization with HA-mC3d3 resulted in higher titers of anti-HA antibodies and higher antibody affinities, compared with serum from mice immunized with sHA or tmHA. Furthermore, the C3d fusion increased the Th2-biased immune response, by inducing IL-4 production. Splenocytes from mice immunized with sHA-mC3d3 produced about three-fold more IL-4 than did splenocytes from mice immunized with sHA or tmHA. Seven days post-challenge with homologous virus (H3N2), no virus was isolated from the mice immunized with HA-expressing plasmids. However, 10 days post-challenge with heterologous virus (H1N1), only mice immunized with sHA-mC3d3 had no virus or microscopic lesions in the kidneys and cerebrum. In conclusion, C3d enhanced antibody responses to hemagglutinin and protective immunity against SIV of different subtypes. 相似文献
20.
试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒（SIV）在小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）、不同H9N2亚型SIV（A/swine/HeBei/012/2008/（H9N2）接种剂量（1：10、1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000和1：10 000 000）及不同病毒吸附时间（0.5、1.0、2.0和3.0 h）条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6 μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10-2病毒稀释倍数感染条件下48和72 h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2 h且中间震荡20 s的条件下H9N2 HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3 μg/mL、病毒接种浓度为10-2、吸附时间为2 h且中间震荡20 s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。 相似文献