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1.
本试验旨在构建表达猪布鲁菌（Brucellasuis）外膜蛋白0mp25蛋白的真核重组表达质粒,并探讨Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞生长活性及细胞因子分泌的影响。以猪布鲁菌基因组DNA为模板,设计带有6×His标签的引物克隆Orap25基因,扩增产物克隆入pCI-neo真核表达载体,双酶切及测序鉴定正确后转染猪肺泡巨噬细胞3D4／21,检测其对巨噬细胞生长活性和分泌细胞因子的影响。RT—PCR和Westernblotting检测结果证实Omp25蛋白获得正确表达。显微镜观察细胞形态表明,Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的形态无明显影响。MTT结果表明,Orap25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的生长活性有轻度但不显著的抑制作用。ELISA检测TNF—α和IL-12蛋白表达水平表明,Omp25蛋白可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12。本试验成功构建了表达猪布鲁菌外膜蛋白Omp25蛋白的真核重组表达质粒,该蛋白对猪肺泡巨噬细胞的细胞形态没有明显影响,对其生长活性有轻度但不显著的抑制作用,可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF—α和IL-12。 相似文献
2.
本试验旨在构建表达猪布鲁菌(Brucella suis)外膜蛋白Omp25蛋白的真核重组表达质粒,并探讨Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞生长活性及细胞因子分泌的影响。以猪布鲁菌基因组DNA为模板,设计带有6×His标签的引物克隆Omp25基因,扩增产物克隆入pCI-neo真核表达载体,双酶切及测序鉴定正确后转染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,检测其对巨噬细胞生长活性和分泌细胞因子的影响。RT-PCR和Western blotting检测结果证实Omp25蛋白获得正确表达。显微镜观察细胞形态表明,Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的形态无明显影响。MTT结果表明,Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的生长活性有轻度但不显著的抑制作用。ELISA检测TNF-α和IL-12蛋白表达水平表明,Omp25蛋白可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12。本试验成功构建了表达猪布鲁菌外膜蛋白Omp25蛋白的真核重组表达质粒,该蛋白对猪肺泡巨噬细胞的细胞形态没有明显影响,对其生长活性有轻度但不显著的抑制作用,可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12。 相似文献
3.
通过原核表达和镍柱亲和层析获得纯度达95%以上的重组旋毛虫蛋白谷胱甘肽S-转移酶(rTs-GST),相对分子质量26 000。分离小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC),体外培养至第7天,加入rTs-GST和rTs-GST+LPS刺激48h后,收集细胞进行流式细胞术和ELISA分析。流式结果显示:rTs-GST可抑制由LPS诱导的树突状细胞(DC)表面MHC-II和CD 86表达率的升高。ELISA结果显示:rTs-GST可促进DC分泌抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β;抑制由LPS诱导的促炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。因此,旋毛虫可能通过蛋白谷胱甘肽S-转移酶改变DC活化和成熟,诱导T细胞向Th 2方向发展,从而调节宿主免疫反应达到长期寄生。 相似文献
4.
试验旨在探究S100A12在胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）诱导猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）炎性细胞因子表达及吞噬中的作用。PAM细胞接种APP菌株后，用实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点炎性细胞因子和S100A12的mRNA表达水平；构建S100A12重组蛋白表达载体并进行重组蛋白的表达纯化，用MTT法检测其对PAM的细胞毒性，实时荧光定量PCR检测不同浓度（0、5、50和500 ng/mL） S100A12重组蛋白对PAM炎性细胞因子mRNA表达水平的影响；构建S100A12干扰质粒，用Western blotting、实时荧光定量PCR及流式细胞术检测其干扰效率及其对APP感染PAM后炎性细胞因子mRNA表达水平和细胞凋亡的影响；用平板计数法检测S100A12表达对APP的黏附侵袭及其在PAM细胞内存活的影响。结果表明，APP感染促进PAM中IL-6、IL-8、IL-18、IL-1β和TNF-α等炎性细胞因子表达的同时也促进S100A12的表达，且该表达随APP感染剂量增大及时间的延长均显著或极显著增加（P<0.05；P<0.01）。5、50和500 ng/mL重组蛋白S100A12对PAM均没有毒性。5和50 ng/mL的重组蛋白S100A12均可显著促进PAM中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-21和IL-5等炎性细胞因子的表达（P<0.05），而高浓度的S100A12重组蛋白则对上述炎性细胞因子表达无影响（P>0.05）。干扰质粒可成功阻断S100A12蛋白的表达，与转染shNC的对照组相比，在APP诱导下转染shS100A12干扰质粒的PAM中细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β和IL-5的转录水平显著或极显著降低，且细胞凋亡率也显著或极显著增加（P<0.05；P<0.01）。进一步研究发现，干扰PAM中S100A12蛋白的表达可显著增强APP对PAM的黏附侵袭能力及其在PAM内的存活能力（P<0.05），相反，体外添加S100A12重组蛋白则显著抑制APP对PAM细胞的黏附侵袭及其在PAM内的存活（P<0.05）。以上研究表明，S100A12具有增强APP感染后PAM炎性细胞因子的表达、抑制APP诱导的PAM凋亡和降低APP对PAM的黏附侵袭及其在PAM内存活的作用，为进一步揭示APP感染过程中S100A12对PAM调控作用及机制奠定了基础。 相似文献
5.
牛分支杆菌侵入巨噬细胞的机制,主要是由哺乳动物细胞侵袭蛋白(Mammalian cell-entry proteins,Mce)介导的,在牛分支杆菌的致病机理中具有重要的作用。为了探讨Mce4A蛋白在牛分支杆菌致病机理中的作用,用不同浓度的重组Mce4A蛋白刺激肺泡巨噬细胞,结果显示,Mce4A蛋白抑制巨噬细胞的活性;用重组Mce4A蛋白、MtbPPD、MbPPD和BCG刺激肺泡巨噬细胞,结果表明,Mce4A蛋白促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS和IL-6的表达上调,而对IL-12的表达没有影响。MbPPD和BCG促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS、IL-6和IL-12的表达上调;MtbPPD促使肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-12的表达上调,但是对i NOS的表达却没有影响。由此可见,Mce4A蛋白能够促使巨噬细胞分泌炎性细胞因子,促使机体发生炎性反应,在宿主细胞免疫应答反应中具有重要的作用。 相似文献
6.
丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫入侵宿主的过程中发挥着关键作用,能够参与到入侵宿主、免疫逃避、炎症反应、凝血系统和细胞迁徙等过程。为了探讨两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ts Ad SPI和Ts Ka SPI)对巨噬细胞所分泌炎性细胞因子的调节作用,应用实时荧光定量PCR技术对两种SPIs分别处理的小鼠巨噬细胞进行TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、TGF-βmRNA表达水平的检测。结果显示,Ts Ad SPI和Ts Ka SPI均可不同程度的抑制LPS活化的小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12 mRNA的表达水平。并且两种SPI均可不同程度的促进巨噬细胞抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。表明这两种旋毛虫SPI可通过调节宿主巨噬细胞影响入侵时宿主的免疫应答。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2015,(12)
为研究丹翘液的体外抗炎作用及其抗炎机制,利用LPS诱导巨噬细胞建立炎症模型,MTT法检测不同浓度丹翘液对RAW264.7细胞活力影响;NO测试盒检测丹翘液对LPS诱导的NO释放量的影响;ELISA方法检测丹翘液对LPS诱导的TNF-α、IL-6和PGE2分泌的影响;RT-PCR方法检测丹翘液对LPS诱导的TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因转录的影响;Western blot检测对细胞核内NF-κB p65蛋白表达的影响。结果显示丹翘液小于700μg·mL-1对细胞无毒性作用;丹翘液各剂量组(100、300、600μg·mL-1)能不同程度地抑制LPS诱导的NO、PGE2、TNF-α和IL-6的分泌;能显著抑制iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6基因转录和细胞核内NF-κB p65蛋白表达。丹翘液的抗炎作用机制可能与抑制NF-κB通路激活,进而抑制炎症介质和炎性细胞因子的转录和表达有关。 相似文献
8.
为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性，利用pET-32a载体系统，构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外，MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性，并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性，同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平；之后通过小鼠攻毒保护试验，测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量，ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化，并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示，成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×106 IU,对细胞没有损害作用，且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平；在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖，减少促炎因子的产生，延缓临床症状的出现。结果表明，原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性，为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。 相似文献
9.
百里香酚对脂多糖诱导的子宫内膜上皮细胞炎性反应的抑制作用研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为探究百里香酚治疗子宫内膜炎的抗炎活性,利用脂多糖(LPS)诱导山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)建立炎性模型,以百里香酚进行干预。采用NO试剂盒和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测百里香酚对LPS诱导的NO和细胞因子分泌的影响;利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测百里香酚对LPS诱导的IL-1β、TLR4和NF-κB基因转录的影响。结果显示:不同剂量的百里香酚(100、50、25μg·mL~(-1))能不同程度地抑制LPS诱导的炎性模型细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和PGE2的分泌,亦可降低炎性模型细胞IL-1β、TLR4和NF-κB的基因转录水平(P0.01)。结果表明,百里香酚可抑制LPS诱导gEECs炎性模型的细胞因子表达水平,具有显著的抗炎活性,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路相关。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(8):1553-1557
为揭示钩吻素子的体外抗炎作用机理,利用硝酸还原酶法和ELISA法研究了不同质量浓度(100,200,400mg/L)的钩吻素子对一氧化氮(NO)和细胞因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌的影响,运用了QPCR的方法检测了钩吻素子对诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平的影响,并运用Western blot法检测了钩吻素子对iNOS蛋白表达的影响。结果显示,100,200,400 mg/L质量浓度的钩吻素子能够极显著的抑制RAW264.7细胞NO的产生以及IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌(P<0.01),同时能够剂量依赖性的降低iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平,抑制脂多糖(LPS)引起的iNOS蛋白表达的升高(P<0.01)。由此推论,钩吻素子可能通过抑制炎症因子的分泌,减少NO的释放,下调iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平,抑制iNOS蛋白过度表达达到其抗炎作用。 相似文献
11.
为了探究猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)非结构蛋白NS1介导炎症反应的情况,将PPV NS1重组质粒转染至PK-15细胞,应用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术分别检测炎性因子IL-6/TNF-α的表达和NF-κB信号通路相关蛋白的激活。结果显示,PPV NS1极显著诱导IL-6和TNF-αmRNA的表达(P<0.01)。PPV NS1可显著促进IκBα的降解、p65的磷酸化来激活NF-κB信号通路(0.01相似文献
12.
《中国兽医学报》2017,(9):1736-1742
为明确酪酪肽(peptide YY,PYY~(3-36))对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2细胞中促炎细胞因子及促炎蛋白酶类的影响,本试验用不同浓度的PYY~(3-36)预处理后,再用LPS刺激BV-2细胞,利用MTT法检测PYY~(3-36)的细胞毒作用;分别用荧光定量RT-PCR和Western blot方法检测促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)及促炎蛋白酶类(iNOS和COX-2)基因水平和蛋白水平表达变化;分别利用NO检测试剂盒和ELISA试剂盒检测iNOS和COX-2的主要产物NO和PGE2;利用PCR方法检测PYY~(3-36)受体表达情况。结果显示,PYY~(3-36)(10-9~10-11 mol/L)呈浓度依赖性抑制LPS在BV-2细胞中诱导的促炎细胞因子和促炎蛋白酶类的基因和蛋白水平,并能浓度依赖性抑制NO和PGE2。PCR结果表明BV-2细胞中PYY~(3-36)受体Y1、Y2、Y5和Y6表达明显,并且LPS刺激后Y2R受体表达增加。表明PYY~(3-36)在BV-2细胞中能抑制LPS诱导的促炎细胞因子和促炎蛋白酶类的表达以及促炎酶类产物的生成,这个过程可能涉及到其受体Y2。 相似文献
13.
14.
本研究旨在探索TNF-α对睾丸支持细胞(SCs)中Fas/FasL表达的影响及机制。用不同质量浓度的TNF-α(0.0,0.1,1.0,10.0,25.0,50.0,100.0,200.0μg/L)处理SCs不同时间(0,6,12,24,36,48,72h)后,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖;通过流式细胞术检测细胞周期进程和细胞凋亡;用Western blot和荧光定量PCR技术检测Fas/FasL、MMP-2/MMP-9和TIMP-2/TIMP-1蛋白水平及其mRNA丰度;利用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IGF-1、TGF-β1等细胞因子水平。结果显示,当TNF-α质量浓度为50.0μg/L、作用时间为36h时,细胞的增殖活力最低;这一条件显著促进了Fas/FasL、MMP-2/MMP-9蛋白及mRNA的表达(P0.05),极显著降低了TIMP-1和TIMP-2mRNA与蛋白表达(P0.01),且极显著促进了细胞促炎性因子IL-1β和IL-6分泌(P0.01),显著抑制了促生长因子IGF-1和TGF-β1分泌(P0.05)。结果表明:TNF-α以剂量和时间依赖方式诱导SCs中Fas/FasL mRNA及蛋白表达,从而诱发SCs凋亡,且Fas/FasL表达受到MMP-2/MMP-9、TIMP-2/TIMP-1以及细胞因子水平的影响。 相似文献
15.
酚可溶性调控蛋白(PSM)是一种新发现的金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞外分泌蛋白,为研究其对人中性粒细胞的生物学作用,本研究通过设计linker将其中编码PSM-α蛋白的PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α4基因串联,并克隆于pGEX-4T-1中。重组菌经IPTG诱导,重组蛋白以可溶形式高效表达。通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化并用凝血酶切除其GST标签,得到的蛋白作用于正常人的中性粒细胞,通过ELISA检测细胞因子IL-1β及IL-8的含量。结果显示,纯化后蛋白刺激中性粒细胞后,IL-8含量显著升高。结果证明,串联表达后的PSM-α蛋白可以刺激中性粒细胞释放炎性因子,诱导炎症的发生,产生致病作用。 相似文献
16.
奶牛乳腺炎是指在不同理化因素刺激下奶牛乳腺的炎性反应,其严重影响了奶牛养殖业的健康发展。许多细胞因子是炎症调节剂,但与奶牛乳腺炎相关的关键细胞因子还未被鉴定。异体移植炎症因子1（allograft inflammatory factor-1,AIF-1）在免疫调节中扮演重要角色,并在多种炎性疾病中过量表达。因此,本研究探讨了牛AIF-1在乳腺炎中的可能作用。首先,利用ELISA试剂盒检测了乳腺炎牛奶中牛AIF-1的含量,并用RT-PCR方法克隆牛AIF-1基因,然后,用亲和层析纯化牛AIF-1蛋白。用此重组蛋白刺激牛乳腺上皮细胞,ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌,Western blot测定IκBα的磷酸化。结果显示,患乳腺炎奶牛乳中AIF-1的平均含量显著高于健康奶牛,而抗生素治愈后的奶牛乳中AIF-1的含量回落到正常水平。这些结果提示,牛AIF-1是一个分泌型蛋白,可能与乳腺炎相关。为了进一步探索这种关系,本研究克隆了牛AIF-1基因并纯化了牛AIF-1蛋白。此蛋白上调了牛乳腺上皮细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌,并刺激了IκBα的磷酸化。IκBα磷酸化抑制剂BAY 11-7085阻断了牛AIF-1刺激的炎性细胞因子上调。综上表明,牛AIF-1通过核因子κB信号促进了牛乳腺上皮细胞炎症因子的释放。 相似文献
17.
利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD.阳性质粒转化宿主菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下获得高效表达.Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点.利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性. 相似文献
18.
《中国兽医学报》2020,(2):361-368
为探讨中药黄连对LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性免疫反应及其信号通路的调控机制,以猪肠道上皮细胞IPEC-J2作为研究对象,MTT法检测不同质量浓度黄连水提物及LPS对猪肠道上皮细胞活性的影响。用0.1,0.5,5.0 g/L黄连水提物预处理猪肠道上皮细胞,再经LPS(5 mg/L)作用1 h后,Real-time PCR法检测促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-ɑmRNA的表达水平,并用Western blot法检测NF-κB/MAPK信号通道关键蛋白表达情况。结果显示,5 mg/L LPS可诱导猪肠道上皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-ɑmRNA的表达水平极显著升高(P<0.01),而经黄连水提物预处理的猪肠道上皮细胞的相关炎性细胞因子的表达水平则出现下降,且与药物质量浓度呈正相关;LPS可有效激活猪肠道上皮细胞NF-κB/MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化和表达,而黄连水提物则可有效降低细胞IκB、p-IκB、p65、p-p65、p-p38、JNK等蛋白的表达,达到抑制NF-κB/MAPK信号通路的传导和调控LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性反应的作用。结果表明,黄连水提物可通过抑制NF-κB/MAPK信号通路的活化及其下游促炎性细胞因子的表达,起到调控LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性反应的作用。 相似文献
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本试验旨在研究高浓度葡萄糖对牛肺泡巨噬细胞（BAMs）促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α释放的影响及其机制是否与RAGE-TLR4相关信号通路串扰有关。将BAMs随机分为正常糖组（NG）、高糖组（HG）、高糖+RAGE抑制剂组（H+F）、高糖+TLR4抑制剂组（H+T）及DMSO组,处理12 h后收集上清及下层细胞。采用qRT-PCR和Western blot检测细胞RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA及蛋白表达情况,ELISA检测上清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度。结果表明,高糖极显著上调RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平以及上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度（P<0.01）;RAGE抑制剂与TLR4抑制剂均极显著抑制高糖引起的RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平上调以及IL-1β、IL-6、TNF-α释放（P<0.01）,即RAGE与TLR4均在激活RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路中发挥调控作用。综上所述,高糖能够通过RAGE-TLR4串扰引起牛肺泡巨噬细胞释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α,进一步阐明了高糖促进牛肺泡巨噬细胞炎症反应的分子机制。 相似文献
20.
通过体外试验观察干扰素-α(IFN-α)对滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化及功能的影响。无菌分离小鼠脾细胞,磁珠分选CD4^+T细胞,加入抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体,重组IL-21、IL-6进行刺激,同时加入重组IFN-α(设不加IFN-α的阴性对照)进行培养,分别在培养后的1、3、5d,流式细胞术检测Tfh细胞(CD4^+CXCR5^+)和CD4^+CXCR5^+PD-1^+细胞的比例;ELISA检测细胞上清中Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的水平;real-time PCR检测培养3d后Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平。结果表明,与阴性组相比,IFN-α能明显促进Tfh细胞的分化及Tfh细胞中PD-1的表达(P<0.05),能提高Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的分泌水平(P<0.05);IFN-α能正向调控Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平(P<0.05)。说明IFN-α可通过正向调控STAT1、Bcl-6的表达,促进Tfh细胞的分化和细胞因子的分泌。 相似文献