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1.
[目的]研究东北红豆杉RAPD反应体系的优化条件。[方法]以东北红豆杉叶片为材料,用改进CTAB法提取DNA,分别从模板DNA浓度（10、20、30、40、50 ng）、引物浓度（5、10、15、20、25 pmol/μl）、dNTP浓度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L）,TaqDNA聚合酶量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U）及镁离子浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）5个方面对东北红豆杉RAPD扩增效果的影响进行分析。[结果]用改良的CTAB法提取红豆杉基因组DNA,所得DNA质量较好,无杂质存在,条带整齐一致,而且能够取得比较理想的RAPD扩增效果。通过各因子的比较分析,建立了东北红豆杉RAPD优化体系：20μl PCR反应总体积中含模板DNA10 ng,Mg2 ＋2.0 mmol/L,引物15pmol/μl,dNTP0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,10×buffer缓冲液2μl,以双蒸水补充至20μl。[结论]为进一步探索与东北红豆杉性别鉴定相关的研究提供技术支持。 相似文献
2.
《江苏农业科学》2017,(16)
利用梭罗草(Kengyilia thoroldiana)基因组DNA优化并建立的梭罗草扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。预扩增反应体系25μL:连接产物1μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.375μL,Mg~(2+)1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,EcoRⅠ预扩引物1μL,MseⅠ预扩引物1.2μL,dd H2O加至25μL;选扩增反应体系25μL:预扩产物(稀释20倍)2.0μL,10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP 0.60μL,Mg~(2+)2μL,Taq DNA聚合酶0.1μL,EcoRⅠ选扩引物1.5μL,Mse I选扩引物2.5μL,dd H2O加至25μL。利用优化后的AFLP体系,从梭罗草、大颖草(K.grandiglumis)、疏花以礼草(K.laxiflora)共10份供试材料中筛选出216对选择性扩增引物,从中筛选出38对具有多态性的引物并从中选出6对条带清晰、鉴别效率高的引物,其中E16C4、E4C10的扩增条带中均有梭罗草的特征条带,为梭罗草的种质鉴定及利用提供科学依据。 相似文献
3.
基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。 相似文献
4.
【目的】建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持。【方法】以广西割手密GXS87—16、GXS85．30、GXS79—9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR I和Mse I酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如Mg^2＋、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化。【结果】样品DNA用限制性内切酶＆0RI和MseI各3u于PCR仪过夜可完全酶切。经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0．4μL dNTPs（20mmol／mL）,1．6μLMg^2＋（25mmol／mL）,2．0μL EcoRI—P（5pmol／mL）,2．0IxLMseI-P（5pmol／mL）,1UTaq酶（1U／μL）,DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0．4μL dNTPS（20mmol／mL）,0．8μLMg^2＋（25mmol／mL）,1．0μL EcoR I—AAG（6pmol／mL）,1．0μL Mse I-CAG（6pmol／mL）,3U Taq酶（1U／μL）,DNA模板稀释20倍。以对优化反应体系扩增获得的PcR产物用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱。【结论】建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持。 相似文献
5.
以粳型旱稻品种焦旱1号总DNA为材料,首先对影响北方粳稻SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了初步优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。在此基础上对影响SRAP-PCR反应的Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等4个主要因素进行了正交优化。研究结果表明,利用引物组合Me6/em7对18个北方粳稻品种进行了成功扩增,最佳条件为:25μL SRAP-PCR反应体系中,模板DNA为20 ng;Mg2+为2.0 mmol/L;dNTP为0.3 mmol/L;正反引物为15 pmol;TaqDNA聚合酶为1.5 U。 相似文献
6.
采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,测试薏苡ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试Mg2 、dNTP、BSA、引物浓度及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等6个因素对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果显示,10μl PCR反应体积中包括:1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),1.75 mmol/L Mg2 ,0.6 mmol/L dNTP,1 mg/ml BSA,10 ng模板DNA,20 pmol引物,0.45 UTaq酶。 相似文献
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采用单因素试验对蛇莓ISSR—PCR反应体系中的6种主要反应因子（模板DNA、Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、BSA、dNTP及引物）进行优化筛选，确立了适合蛇莓ISSR分析的最佳PCR扩增反应体系，即10μl PCR反应体积中含：1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液（10mmol／L Tris·HCl，pH值9．0；50mmol／L KCl；0．1％Triton X-100），1．75mmol／L Mg^2＋，2mg／ml BSA，0．2mmoL／L 4×dNTP，10ng模板DNA，18pmol引物，0．5U Taq DNA聚合酶。 相似文献
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红景天种内遗传多样性分析AFLP方法建立 总被引：4，自引：0，他引：4
研究建立一种用于药用植物红景天种内遗传多样性分析的AFLP分子标记方法.以提取红景天(Rhodiola.rosea L)种基因组DNA为模板,25 μL酶切体系中采用两步双酶切(Mse I、EcoR I),在20 μL连接体系中采用T4连接酶,22℃连接过夜,50 μL体系预扩增,Taq Plus酶2.5 U,dNTP 160 μM,对应引物0.5 μM,10×PCR Buffer(含Mg2+) 4.5 μL,25 μL体系选择性扩增,Taq Plus酶1.5 U,dNTP 80 μM,对应引物 0.25 μM,10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5 μL.AFLP分子标记技术是一种快速、准确、稳定的药用植物红景天的种内遗传多样性分析手段. 相似文献
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泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物. 相似文献
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柿AFLP银染技术体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。 相似文献
13.
建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。 相似文献
14.
试验对内切酶EcoRⅠ和MseⅠ的用量和酶切时间、预扩和选扩过程中模板稀释倍数以及扩增引物浓度分别进行了优化,并采用了Bassam法和Sanguinetti银染法进行了比较分析。结果表明:采用3UEcoRⅠ和MseⅠ这两种酶在37℃下酶切3 h,预扩模板稀释10倍和1.5 ng/μL引物进行预扩,选扩模板稀释20倍和2 ng/μL引物进行选扩,采用Bassam法进行银染,能够得到较好的试验结果,为AFLP进一步在披碱草属中的应用提供了参考。 相似文献
15.
[目的]建立和优化华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtii Mayr.）的AFLP反应体系。[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素（酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数）进行了研究。[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0μl的前提下,酶切时间为7 h（37℃3.5 h;65℃3.5 h）,EcoRⅠ和MseⅠ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0μl（50 ng/μl）,连接产物稀释10倍取5.0μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0μl用于选择性扩增。[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究。 相似文献
16.
对甜槠Castanopsis eyrei 进行遗传多样性研究的过程中, 为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR 扩增结果, 利用正交设计对Mg 2+ , dNTP , 引物, Taq 酶, 牛血清蛋白(BSA )和模板DNA 等6 种因素5 个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR 最适宜反应体系为:10 L 反应体中, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 10 gL-1 TritonX-100), 1.7 mmolL-1 Mg 2+ , 0.25 mmolL-1 dNTP , 8.34 nkat Taq DNA 聚合酶, 1.5 gL-1牛血清白蛋白, 6 pmol 引物, 12 ng 模板DNA 。甜槠扩增时引物UBC846 的最适退火温度为56.3 ℃。图2 表1 参23 相似文献
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建立并优化了石蒜属Lycoris植物的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应（SCoT-PCR）反应体系,为研究石蒜属种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良提供新的思路。采用L25（56）正交试验和单因素试验2种方法优化石蒜属植物SCoT-PCR体系。得出石蒜属植物SCoT-PCR 最佳反应体系:DNA 模板2.0 mgL－1,引物0.125 molL－1,三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs ）0.2 mmolL－1,镁离子（Mg2+） 3.0 mmolL－1,Taq DNA聚合酶1.016.67 nkat。对优化的反应体系进行通用性、稳定性及可靠性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰的DNA谱带。最后可知SCoT 新型标记在石蒜属植物中应用效果良好,可为石蒜属植物以后的研究提供基础条件。图7表6参25 相似文献