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以常规PCR为对照,分析了实时荧光定量PCR(q PCR)检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度,并对接种柑橘溃疡病菌后的冰糖橙样品进行了动态监测。结果显示,q PCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高1~3个数量级,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到寄主植物DNA的干扰,q PCR不受寄主植物DNA影响;对接种后冰糖橙样品的分析,q PCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能实时观察到柑橘溃疡病菌在寄主叶片的增殖情况,而常规PCR要接种后2 d才能检测到柑橘溃疡病菌。 相似文献
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《浙江农业学报》2017,(1)
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测已用于基层植物检验检疫中的疑似样品检测诊断。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)是重要的检疫性病害,根据柑橘溃疡病菌基因组中一段保守序列设计LAMP引物,建立了柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只对柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病病斑总DNA进行扩增,而对非靶标菌DNA和非靶标病斑总DNA不发生扩增,特异性与PCR一致。该LAMP检测方法最低可检出100 pg的纯柑橘溃疡病菌DNA和最低每微升4个细菌,灵敏度均比PCR高了1 250倍。LAMP检测法能很好地区分症状极易混淆的柑橘溃疡病和疮痂病。该试验建立的柑橘溃疡病菌LAMP检测方法具有简单、快速、灵敏和特异等优点,可在条件相对简陋的实验室应用。 相似文献
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柑橘溃疡病菌免疫荧光检测技术研究 总被引：1，自引：0，他引：1
选取不同浓度的柑橘溃疡病菌SOB培养液,利用载玻片进行固定、封闭、抗体结合、免疫荧光标记及荧光强度检测,以探讨免疫荧光检测技术在柑橘溃疡病菌快速检测方面的应用。结果表明,30℃下用BSA封闭2h,30℃下抗体结合1 h,荧光抗体浓度为4μg/mL,室温放置40 m in后,在荧光显微镜下可以清楚看到绿色的柑橘溃疡病菌体。该方法操作简便,检测过程仅需4 h,抗原抗体反应特异性极强,检测灵敏度可达103cfu/mL。 相似文献
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[目的]明确保存的放线菌资源对柑橘溃疡病菌的抑制作用和抑菌机理.[方法]通过平板对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌Xanthomonasaxonopodis pv.citri）有抑制作用的放线菌菌株,并采用电导率法、考马斯亮蓝法和斐林试剂法测定拮抗菌株发酵滤液对溃疡病菌的影响.[结果]筛选出3个对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的放线菌菌株,抑菌圈直径达42.0～60.0 mm,且该3株放线菌发酵液能提高溃疡病菌菌液电导率,增加还原糖和蛋白质含量.[结论]3株拮抗菌能破坏柑橘溃疡病菌细胞膜完整性,增加细胞膜通透性,引起细胞质外渗. 相似文献
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通过测定苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑菌活性、菌液的OD600nm值、电导率、蛋白质含量、保护酶和呼吸代谢途径酶活性,探索苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑菌机理。结果表明:苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的室内平板抑菌圈直径在15 mm以上,最低抑菌质量浓度MIC为3.68 mg/m L;苋菜乙酸乙酯提取物不仅延迟了病原菌进入对数生长期的时间,而且使其电导率增加了15%;苋菜乙酸乙酯提取物对过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的酶活力的抑制率分别为78.43%、68.63%、63.14%、68.00%。扫描电镜观察发现,苋菜乙酸乙酯提取物使柑橘溃疡病菌的菌体细胞膜遭受损伤,菌体发生裂解;透射电镜观察发现,苋菜乙酸乙酯提取物使柑橘溃疡病菌的细胞壁和细胞膜结构受损,胞内空白面积增大,细胞质外泄,菌体裂解。 相似文献
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GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白（Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973）可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。 相似文献
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【目的】明确来自广东和江西两省柑橘溃疡病菌菌株之间的分子水平差异.【方法】使用ERIC引物,通过REP-PCR技术,对来自我国广东和江西省12个市(县)12个柑橘品种的71个柑橘溃疡病菌株进行遗传多样性研究.根据DNA指纹特征,并用NTSYS软件聚类分析.【结果和结论】71个菌株在相似值为0.64时,可以分为A、B两簇,其中来自江西赣州6个市县的所有溃疡病菌株全部聚在A簇,而来自广东有50%的菌株聚在B簇.取相似值为0.88时,A、B簇又各自分为6个遗传组.广东和江西两省柑橘溃疡病菌存在明显的遗传多样性,不同地理来源和不同柑橘品种之间的溃疡病细菌多样性差异明显. 相似文献
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为了筛选对柑橘溃疡病菌有强烈抑制作用的化学药剂,通过室内平皿菌落计数法,检测了70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素5种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的抑制作用。毒力测定表明:70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的EC50值分别为265.71、93.86、162.89、127.61、38.62μg/mL。根据EC50值分析,72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的室内抑制作用最强,20%噻菌铜悬浮剂次之,70%氢氧化铜可湿性粉剂的效果最差,其抑制作用为72%农用硫酸链霉素>20%噻菌铜悬浮剂>77%多宁可湿性粉剂>3%中生菌素可湿性粉剂>70%氢氧化铜可湿性粉剂。 相似文献
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柑橘黑点病是一种严重危害柑橘生产的世界性真菌病害,快速及时地检测出柑橘黑点病病菌(Diaporthe citri)对柑橘黑点病早期诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于β-微管蛋白序列,设计柑橘黑点病病菌的特异引物对,基于常规PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR(qRT-PCR)建立了快速分子检测体系,对柑橘黑点病病菌的菌丝和典型带病叶片进行检测验证。结果发现,在常规PCR检测中,该引物可从柑橘黑点病病菌获得244 bp的特异性扩增片段,检测灵敏度达0.78 ng·μL-1;在实时qRT-PCR中,该引物也只有在柑橘黑点病病菌中获得唯一的产物吸收峰,检测灵敏度达0.35 ng·μL-1。利用PCR检测体系对发病黑点叶片进行检测,结果显示,常规PCR的阳性检出率为30%,qRT-PCR的阳性检出率为60%,表明qRT-PCR比常规PCR的灵敏度更高。因此,研究设计的柑橘黑点病病菌特异性引物,以及所建立的常规和实时qRT-PCR检测方法具有速度快、特异性强等特点,可以用于柑橘黑点病病菌的分子鉴定,对病害诊断具有参考价值。 相似文献
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柑橘响应溃疡病菌转录因子CsBZIP40的克隆及功能分析 总被引：3，自引：3，他引：0
【目的】分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子Cs BZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系。【方法】基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的Cs BZIP40所属的类型;结合染色体定位和系统发育树确定该家族的基因复制情况;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法验证感染溃疡病菌前后由柑橘转录组筛选出的Cs BZIP40表达模式;分析Cs BZIP40、启动子元件(plant CARE)和核定位信号(c NLSmapper),构建GFP融合载体,用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,来对预测的核定位信息进行验证;利用q RT-PCR技术分析水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(wounding)对该基因的诱导表达模式,揭示该转录因子与激素代谢途径的关系。【结果】从柑橘(甜橙)全基因组数据库中共注释到47个BZIP,这些BZIP基因位于9号染色体之外的所有染色体上,其中3号染色体基因密度最大为4.5×10-7个/Mb,2号染色体上的BZIP基因密度最小,仅占所有BZIP基因的2%;柑橘BZIP基因家族含有较少的基因复制事件,所以相对其他已测序物种其BZIP家族较小;Cs BZIP40基因全长5 756 bp,开放阅读框1 530 bp,编码509个氨基酸;经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示Cs BZIP40基因序列特异性较好,且Cs BZIP40与拟南芥中AT1g08320属于同源基因,属于柑橘10个亚家族中参与病菌防御的D亚类;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等;此基因含有核定位信号,亚细胞定位表明此蛋白定位于细胞核,具备转录因子发挥作用的前提;外源水杨酸并不会使四季橘和纽荷尔脐橙中Cs BZIP40的表达水平显著上调,纽荷尔脐橙在茉莉酸甲酯诱导后有明显的差异表达,但乙烯利可以使Cs BZIP40在四季橘和纽荷尔脐橙中均有较明显的差异表达;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中,该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应。【结论】Cs BZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个转录因子,该基因可作为柑橘抗溃疡病菌分子育种的一个候选基因来进行进一步功能性验证,具有潜在的分子育种价值。 相似文献
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梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用 总被引：1，自引：1，他引：0
本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。 相似文献
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杀菌剂对柑橘溃疡病菌的毒力测定 总被引：1，自引：1，他引：0
为了筛选对柑橘溃疡病菌有强烈抑制作用的化学药剂,通过室内平皿菌落计数法,检测了70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素5种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的抑制作用。毒力测定表明：70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的EC50值分别为265.71、93.86、162.89、127.61、38.62 μg/mL。根据EC50值分析,72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的室内抑制作用最强,20%噻菌铜悬浮剂次之,70%氢氧化铜可湿性粉剂的效果最差,其抑制作用为72%农用硫酸链霉素>20%噻菌铜悬浮剂>77%多宁可湿性粉剂>3%中生菌素可湿性粉剂>70%氢氧化铜可湿性粉剂。 相似文献
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本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件的优化建立了柑橘黄龙病菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条RAA-LDF检测方法,该方法可用于快速高效完成柑橘黄龙病菌检测,试验结果表明该方法灵敏度可达到100copies/uL,特异性试验结果显示除柑橘黄龙病菌基因组呈阴性外, 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、 支气管败血波氏杆菌、沙门氏菌均为阴性,特异性良好。利用该方法检测102 份柑橘叶样本,提取核酸后经过 RAA-LDF 检测法,结果显示 53 份样本核酸为阳性,49 份样本核酸为阴性,与PCR,RAA方法比较,弱阳的检出率偏低,但是 RAA-LDF 检测法摆脱仪器依赖,操作更简便快速,无需电泳检测,避免核酸扩增产物开盖污染的风险,适宜于柑橘黄龙病菌的快速检测,适合在基层使用。 相似文献
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柑橘溃疡病菌的药剂筛选及抗药性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
柑橘溃疡病是柑橘生产上重要细菌病害,药剂防治是其主要的防治措施.本文通过平板抑菌圈试验,测定了来自广东和江西等地的21个柑橘溃疡病细菌对8种化学药剂的敏感性.结果表明:叶枯唑1 000×、新植霉素2 800×、水合霉素1 300×等3种药剂对供试的21个柑橘溃疡病菌菌株均没有抑菌作用;链霉素、中生菌素、溃疡克星、氢氧化铜.锌和必备等5种药剂对溃疡病菌表现不同程度的抑菌作用,其中,链霉素的抑菌作用最强;部分溃疡病菌株对这5种药剂产生了不同程度的抗药性.田间试验结果表明,链霉素、中生菌素对溃疡病防治效果较好. 相似文献
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台湾柠檬上柑橘溃疡病菌的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
《浙江农业学报》2017,(1)
从送检台湾柠檬样品上发现疑似柑橘溃疡病病斑,对病原菌进行了分离纯化,并且通过形态学特征观察、致病性测定、特异性引物扩增和gyr B序列比对分析,对其进行了鉴定。结果显示,菌株6503在NA培养基上菌落呈黄色,圆形,全缘,有光泽,微隆起,黏稠;致病性测定结果显示,分离物6503能够导致柑橘叶片产生明显的溃疡病斑;柑橘溃疡病菌种特异性引物Xac01/Xac02从菌株6503的DNA中扩增得到581 bp的特异性条带;基于gyr B序列构建的系统发育树中6503和柑橘溃疡病菌处于同一分支,亲缘关系最近。根据试验结果,菌株6503被鉴定为柑橘溃疡病菌。 相似文献
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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害,严重威胁着世界柑橘产业的发展。该病害由难培养细菌——候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)所引起,通过带病苗木和媒介昆虫进行传播蔓延。近年来,随着DNA测序技术和生物信息学的发展,基因组学被广泛应用于柑橘黄龙病的研究,并为克服黄龙病菌难培养所造成的研究瓶颈提供了新的方法和思路。柑橘黄龙病菌基因组学的研究,不仅有助于探究黄龙病菌与寄主植物的互作关系,而且可为抗病栽培和病害早期检测提供重要的理论基础。本文结合当前柑橘黄龙病的研究概况、病原全基因组的测序策略及基因组的特征描述,重点综述基因组学在黄龙病致病机理、病原遗传多样性与分子检测等方面的研究进展。 相似文献
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本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针，通过对反应条件的优化，建立了柑橘黄龙病菌RAA-LFD检测方法。该方法可快速高效地完成柑橘黄龙病菌检测，灵敏度可达到10 copies/μL；特异性试验结果显示，除柑橘黄龙病菌基因组呈阳性外，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、沙门氏菌均为阴性，特异性良好。利用该方法检测102份柑橘叶样本，结果显示，56份样本核酸为阳性，46份样本核酸为阴性；与荧光定量PCR法、RAA荧光法比较，RAA-LFD检测法弱阳的检出率偏低，但是RAA-LFD检测法摆脱了仪器依赖，操作更简便快速，无需电泳检测，避免了核酸扩增产物开盖污染的风险，适用于柑橘黄龙病菌的快速检测，适合在基层使用。 相似文献
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《中国农业科学》2020,(10)
【目的】了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑(Fortunella japonica)和敏感品种枣阳小叶枳(Poncirus trifoliata)的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20(GenBank登录号分别为MN689609和MN689608)序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列(GenBank登录号分别为MN689611和MN689610)虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。 相似文献