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1.
【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。 相似文献
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[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)多克隆抗体,为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础.[方法]采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck,然后转入大肠杆菌B21(DH3)中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价.[结果]尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值(GRAVY)为-0.454,属于亲水性蛋白,具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,无典型的跨膜区.经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD,主要以包涵体形式存在.免疫日本大耳白兔后可获得效价为1:256000的Lck多克隆抗体,且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白.经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上,纯度约95%,抗体纯化效果良好.[结论]经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性,可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究. 相似文献
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【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。 相似文献
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【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-Ⅰ)原核表达载体,表达可溶性Fdn-Ⅰ蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-Ⅰ在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-Ⅰ全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-Ⅰ,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-Ⅰ与GST融合表达载体pEGX-Fdn-Ⅰ,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-Ⅰ可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-Ⅰ蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-Ⅰ的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3mmol·L-1条件下表达出大小为41.3kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-Ⅰ的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-Ⅰ在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-Ⅰ大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-Ⅰ的表达。 相似文献
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[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持. 相似文献
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【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。 相似文献
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《福建农业学报》2019,(9)
【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2 048 000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]探索棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的最佳表达条件。[方法]采用PCR从其基因组中扩增出orf99编码区,将其克隆到pGEM-Teasy载体,测序后将其亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,转化大肠杆菌BL21加入IPTG诱导融合表达。并在orf99缺失杆粒HaBac△99的基础上构建了orf99敲除子HaBac-KO99及回复子HaBac-Rep99。[结果]SDS-PAGE分析表明,GST-Ha99融合蛋白得到成功表达,Westernblot进一步分析表明融合蛋白已得到成功表达。此外,PCR及酶切验证各载体构建成功。[结论]为orf99功能的进一步研究奠定基础。 相似文献
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[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。 相似文献
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[目的]构建截短型AMA1的原核表达载体,并进行体外诱导表达,为在体外表达弓形虫AMA1重组蛋白。[方法]设计去掉弓形虫AMA1信号肽的PCR引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物酶切后与pGEX-4T-3原核表达载体连接,并转化到BL21感受态细胞内。对经PCR鉴定为阳性的重组质粒pGEX-4T-3-AMA1进行体外诱导表达。[结果]成功构建了弓形虫AMA1的原核表达质粒pGEX-4T-3-AMA1,通过体外诱导表明,AMA1融合蛋白是以包涵体的形式存在。[结论]弓形虫AMA1蛋白的体外表达为进一步制备抗AMA1血清及免疫学实验奠定了基础。 相似文献
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[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因（ITGB6）胞外区,然后将其重组到pET-32a（＋）质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导及蛋白纯化。[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶2 560。[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因。 相似文献
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[目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白.[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,转化入BL21表达菌株,经IPTG诱导,并使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物,通过Glutathione Resin亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白.[结果]试验成功构建了pGEX-4T-1-osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌.通过SDS-PAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白.[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白.该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础. 相似文献
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[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
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[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。 相似文献