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[目的]将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(t)中。[方法]以热产硫化氢高温厌氧杆菌菌液为模板,根据编码结构域Tt APuX25的基因片段Tt apux25设计1对特异引物进行PCR扩增。将Tt apux25克隆到表达载体pET21a(+)中,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个250～500bp的扩增片段。对获得的阳性克隆进行筛选和测序鉴定,发现所得阳性克隆为表达载体pET21a(+)中插入有序列正确的Tt apux25片段。阳性克隆中的重组质粒被命名为pEX25,并将其转化进表达宿主菌大肠杆菌Tuner感受态细胞中。[结论]该方法直接将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(+)中,操作简便并取得了较好的效果。 相似文献
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利用多聚酶链反应技术,扩增出编码结构域Tt APuX21的基因Tt apux21,然后将Tt apux21克隆到表达载体pET21a( )中.得重组质粒.重组质粒命名为pEX21,并转化到表达宿主菌大肠杆菌Tuner 中.30℃、O-1mmol·L-1 IPTG诱导5h后.SDS-PAGE检验表明Tt APuX21获得高效表达.将表达产物加入到TalonTM树脂中,进行金属离子亲和层析,得纯化产物. 相似文献
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以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒. 相似文献
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从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k 538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达栽体pET -30 a(+)上构建重组表达质粒pETlac 4.将pETlac 4电击转化到大肠杆菌BL 21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3 h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475 U/mL,37℃仅为0.134 U/mL. 相似文献
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为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍. 相似文献
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采集河南自然发病的烟草.通过摩擦接种至实验室烟草后直接提取总RNA,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得了烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-HN CP)基因;经Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理的PCR产物,连接克隆至大肠杆菌表达栽体pET28a( ),构建了重组质粒pPVYCP,所获得的重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实正确插入了PVY-HN CP基因的全长ORF.序列分析表明,PVY-HN CP基因由804个核苷酸组成,编码267个氨基酸残基;重组的pPVYCP表达载体转化大肠杆茵BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导.SDS-PAGE电泳显示分子量为32 kDa的CP蛋白得到了诱导表达. 相似文献
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目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达. 相似文献
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《河南农业科学》2018,(11)
为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化。通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136—645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136—645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析进行鉴定,并纯化Cap136—645蛋白。结果表明,成功构建了pET30a(+)-Cap136—645重组表达质粒,且可在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中可大量表达,表达的重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约为27.5 ku,纯化的蛋白质质量浓度高达1.28μg/μL,且条带单一。 相似文献
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研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建.通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体.经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为1... 相似文献
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大白菜开花基因 LFY的克隆及dsRNA抑制载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
以中国大白菜花蕾为材料,通过RT-PCR方法,参照GeneBank公布的序列克隆了Leafy(简称LFY)基因片段,测序分析结果表明,该基因与国外已经报道的序列具有94％的同源性。将此序列以相反方向插入到植物表达载体pROK2 35S启动子之间,并在2反向重复片段之间插入小麦乙酰辅酶A羧化酶的第20内舍子,从而构建了dsRNA抑制双元载体,该载体的构建为通过农杆菌介导转化大白菜进而解决早春扣反季栽培大白菜的先期抽薹问题创造了条件。 相似文献
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将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列. 相似文献
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【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。 相似文献
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Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子.根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列.将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28.在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts, PEF).免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达. 相似文献
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【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。 相似文献
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根据吸水链霉菌“应城变种10—22”的一个文库质粒pHZ1392的测序结果设计了1对引物,聚合酶链反应扩增编码TetR的663bp基因,利用T载体和蓝白斑筛选构建了克隆质粒T-TetR,经序列测定确认扩增序列正确后克隆至pET24a,构建了表达质粒pET24a—TetR,再经序列测定确认未发生移码后转化表达宿主菌E.coli D1521(DE3),IPTG诱导后的SDS—PAGE分析显示蛋白表达获得成功,并进一步利用Ni—NTA树脂纯化了TetR蛋白。 相似文献
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[目的]检测猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白（Cap）的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因（Cap）设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a（＋）中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a（＋）进行可溶性表达。 相似文献