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【目的】获得靶向猪囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因的特异锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN),为建立CFTR基因敲除猪细胞系提供技术支持。【方法】通过开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选,首先以已知三锌指蛋白为框架,随机突变单个锌指关键位点氨基酸编码序列,建立人工三锌指蛋白随机库;然后应用细菌双杂交技术,从库中筛选出能够结合CFTR基因靶位点的三锌指蛋白;最后将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ组装成特异ZFN,通过酵母验证体系,检测ZFN靶向切割其识别序列的效率。【结果】获得3个人工三锌指蛋白随机库,每个库约含有2×106个单克隆,通过2轮细菌双杂交筛选,分别获得48个针对CFTR基因左右两侧靶位点的三锌指蛋白。ZFN活性验证结果表明,约90%的ZFN能够在酵母细胞内实现靶向切割,获得了高效特异的ZFN。【结论】获得了猪CFTR基因高效特异的ZFN。 相似文献
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【目的】以猪基因组为模板,扩增天然锌指,以此建立人工锌指蛋白文库,为猪基因组的定点操作及基因表达研究奠定基础。【方法】利用质粒JMB378和JMB440构建锌指文库骨架载体JMB378-ZF1-MCS,然后根据天然锌指蛋白接头序列的保守性,设计5条简并引物扩增猪基因组中的天然单锌指结构域,将其与JMB378-ZF1-MCS载体上的人工锌指ZF1中识别GGC的锌指蛋白连接,构建二锌指蛋白文库,通过酶切方式再将天然单锌指结构域插入到二锌指蛋白文库中,构建三锌指蛋白文库。测定锌指库容量及阳性率,并通过酶切和测序检测锌指库的多样性。【结果】构建了基于猪天然锌指模块的包含ZF1的三锌指蛋白文库,库容量达到1.5×106 CFU。该文库中含有一个人工锌指蛋白ZF1和2个天然型锌指蛋白,能够对基因组中所有以GGC起始的9bp靶序列进行筛选。【结论】构建了基于天然单锌指模块的三锌指蛋白文库,为构建新型锌指蛋白提供了一种可行的方法。 相似文献
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锌指核酸酶技术是一种新兴的基因高效靶向修饰和调控技术,目前该技术已在人类疾病的基因治疗中得到应用,通过敲除致病基因使其丧失致病性或者通过修复突变基因使基因表达正常,实现了对多种人类疾病的基因治疗。基于提高锌指核酸酶效率、特异性和降低细胞毒性等方面的研究较少的现状,特就人工锌指核酸酶介导的基因敲除和基因同源重组修复等在人类疾病基因治疗方面的应用及存在问题进行了综述,并对相关研究的开展进行了展望。 相似文献
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【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。 相似文献
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A20/AN1锌指蛋白普遍存在于真核生物中,在胁迫响应引起的信号传导过程中发挥着重要作用。本文利用生物信息学和RT-PCR方法从低温干旱胁迫的沙冬青叶片组织中分离锌指蛋白基因AmSTZF,该基因编码一条含172个氨基酸残基的多肽,含A20和AN1两个锌指蛋白保守结构域,属A20/AN1锌指蛋白。生物信息学分析显示该蛋白定位于细胞质中,具有磷酸化位点,参与细胞转录调控。RT PCR分析表明:低温和干旱胁迫处理的沙冬青叶片中,AmSTZF的表达增强,初步推测该基因与沙冬青低温、干旱胁迫响应相关。 相似文献
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C2H2型锌指蛋白在植物响应逆境胁迫以及激素信号转导过程中起着重要作用,为了发掘响应干旱胁迫的谷子C2H2型锌指蛋白基因(SiC2H2),利用转录组测序技术构建谷子聚乙二醇(PEG)处理前后转录组文库,根据表达谱数据鉴定出11个SiC2H2差异表达基因,对其进行理化性质、启动子元件等部分生物信息学分析和进化树及基因结构分析。实时荧光定量逆转录PCR(RT-PCR)验证结果表明,随机选取的4个基因在PEG胁迫前后的表达特点与表达谱数据基本一致。研究结果为后续进一步研究C2H2型锌指蛋白在谷子抗旱性中的作用以及谷子抗旱分子育种提供了理论依据。 相似文献
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锌指蛋白是具有典型锌指结构特征的超蛋白家族,几乎参与了生物体生长发育的各个阶段,其中CCCH型锌指蛋白包含一个或多个由三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的基序。本文综述了植物CCCH锌指蛋白的结构、作用方式、功能等方面的研究进展,并对其应用前景进行了展望。 相似文献
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拟南芥Atfin1锌指蛋白的细胞定位 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]确定拟南芥锌指蛋白基因Atfin1的效应部位。[方法]用Trizol提取拟南芥叶片的总RNA,根据GeneBank数据库中Atfin1cDNA全序列设计引物,进行Atfin1的PCR扩增,克隆Atfin1基因,并进行同源性比较,构建pBI-Atfin1-EGFP融合表达载体,对Atfin1进行定位。[结果]克隆得到的拟南芥Atfin1蛋白氨基酸序列同紫花苜蓿Atfin1蛋白氨基酸序列的同源性达78.60%,在接近C-末端区域形成锌指结构的8个氨基酸残基高度保守,与周围的氨基酸残基共同形成典型的C4HC3基序。融合有Atfin1的绿色荧光蛋白只在细胞核区域表达,而未做融合的绿色荧光蛋白在整个细胞内呈弥散状分布。Atfin1没有典型的核定位信号,但仍然能够准确地在细胞核内表达。[结论]Atfin1在细胞核内表达,符合作为转录因子的表达特征。 相似文献
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一个逆境诱导表达的水稻锌指蛋白基因的分离和鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
为鉴定逆境应答相关转录因子,以1个水稻EST为基础,通过RT-PCR分离到了1个编码锌指蛋白的转录因子新基因的全长cDNA,命名为OsZF19。该基因编码171个氨基酸,包含zf-AN1和zf-A20两个锌指结构域,预测的该基因启动子区含有逆境应答顺式元件。Northern杂交分析表明,OsZF19的确受到高盐和植物激素ABA胁迫的诱导,而在干旱胁迫早期显著地诱导表达,胁迫后期OsZF19的表达量轻微下降。试验结果表明,OsZF19可能在水稻对干旱和高盐逆境的应答反应中发挥作用。 相似文献
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【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21（H21）及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA诱导的表达谱进行分析,并结合启动子区顺式作用元件分布情况进行对比分析。将ZmAN14编码序列克隆至GFP表达载体pMDC85,利用亚细胞定位技术验证ZmAN14在胞内的定位情况。将ZmAN14克隆至GAL4 DNA结合结构域载体,并转化酵母,将其涂布在缺陷培养基上观察酵母生长情况,分析其有无转录激活活性。将ZmAN14编码区与植物表达载体p1300-221连接构建超表达载体,并将其转入烟草,选择ZmAN14 mRNA 表达量高的T2纯合体株系进行盐、干旱胁迫和ABA诱导,观察其对非生物胁迫的应答。【结果】序列分析表明,ZmAN14开放阅读框（ORF）为516 bp,编码一个171个氨基酸的蛋白,预测分子量为18.3 kD,等电点是8.28。ZmAN14具有A20和AN1结构域,属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。实时定量荧光PCR结果表明ZmAN14在叶中大量表达,受NaCl、干旱胁迫和ABA诱导上调。ZmAN14与GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞核中,定位结果与ZNF216 和ZmAN13类似,而ZmAN14本身并没有核定位信号,暗示ZmAN14与其他蛋白结合进入细胞核中发挥其生物学功能。ZmAN14在酵母中表达时不能在酵母缺陷培养基（SD/-Leu-His medium）上生长,因此,未发现其具有转录激活活性。将ZmAN14在烟草中过表达会增加烟草苗期对盐和干旱的抗性。【结论】ZmAN14属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。ZmAN14主要在叶中表达,受非生物胁迫和ABA诱导,在烟草中过表达可以提高烟草苗期对盐和干旱的抗性。ZmAN14可能通过与其他蛋白的互作行使功能。相比较于其他的A20/AN1型锌指蛋白,在转基因烟草中,ZmAN14也参与非生物胁迫应答。ZmAN14与ZmAN13具有高同源性,但在盐和干旱胁迫时,二者却具有向反方向调控的功能。 相似文献
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DHHC型锌指蛋白参与细胞内蛋白质的棕榈酰化修饰,对植物的生长发育、器官形成、生殖发育及胁迫响应等生命活动具有重要的调控作用。基于油茶叶片转录组数据,筛选出23个DHHC型锌指蛋白基因,应用生物信息学方法对其蛋白理化性质、结构域、系统进化等进行了分析。结果表明,23个DHHC型锌指蛋白的序列大小为195~725 aa,均包含一个保守的DHHC-CRD结构域,大部分DHHC型锌指蛋白具有4个跨膜区,主要定位于细胞核和细胞膜中。系统进化分析将其分为4类,与拟南芥和水稻均有不同程度的同源关系,DHHC型锌指蛋白在不同物种间具有遗传保守性。23个DHHC型锌指蛋白基因在结实量大和结实量小的单株的不同发育时期叶片中均有不同程度的表达。CoDHHC9、CoDHHC13、CoDHHC22在油茶抽梢生长期的叶片中表达上调;CoDHHC6、CoDHHC12、CoDHHC18、CoDHHC23在花芽分化时期和果实成熟时期的叶片中表达量较高,且在结实量较小而开花较多的单株中表达上调更为明显,这些基因可能参与油茶花芽分化及花朵发育过程;CoDHHC5、CoDHHC11、CoDHHC15在不同时期的叶片中表达量均较低。研究结果为进一步对油茶DHHC型锌指蛋白家族基因的克隆和功能分析提供依据,有助于进一步研究该基因家族在油茶生殖发育中的调控功能。 相似文献