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为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。 相似文献
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为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。 相似文献
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为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。 相似文献
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李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。 相似文献
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盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E. coli. BL21 (DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。 相似文献
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为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。 相似文献
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马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。 相似文献
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将枯草杆菌ylnF基因经PCR扩增,酶切后插入表达质粒pET15b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,金属螯合亲和层析一步纯化,酶活性测定。结果表明:ylnF基因编码产物是依赖于NAD 的前咕啉-2氧化酶,一个西罗血红素生物合成末端的酶。SDS-PAGE显示YlnF亚基分子量约22kD,全酶分子量约25kD,显示酶为单体酶。将Asp102定点突变Ala102,酶活丧失,表明Asp102在催化中起重要作用。 相似文献
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人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。 相似文献
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础. 相似文献
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DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(GenBank登录号为KX396051),其开放读码框全长为2 355 bp,编码784个氨基酸;与牛、斑马鱼、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分别为91.7%,57.5%,88.0%,82.3%,83.8%和48.9%;该基因编码的蛋白结构域和人、牛、小鼠、大鼠一样,其C端都具有保守的GUCT结构域;系统进化树分析表明猪DDX21与牛DDX21的亲缘关系最近。进一步构建原核表达质粒p ET28a-DDX21,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),对DDX21基因进行原核表达。经SDS-PAGE分析显示重组菌可表达分子量约为90 k Da的融合蛋白,与预期相符;在IPTG诱导浓度一定的条件下,重组菌的最佳诱导时间为5 h。猪DDX21基因的克隆和原核表达,为进一步研究DDX21蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。 相似文献
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【研究目的】从苹果果实中克隆细胞质型NADP-苹果酸酶（NADP-ME）基因，并且从基因转录水平上研究该基因与苹果果实酸度的关系。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆NADP-ME基因，半定量RT-PCR分析该基因在高酸和低酸个体不同发育时期果实中的转录情况，并进行原核表达分析。【结果】成功克隆了细胞质型NADP-ME基因的cDNA全长序列，命名为Mal-ME (GenBank注册号：DQ280492)；该基因表达一个约66kD的蛋白；半定量RT-PCR分析表明：不同发育时期的果实中Mal-ME的转录与苹果酸含量呈负相关，即随着Mal-ME转录水平的增强果实含酸量下降。【结论】成功从苹果果实中克隆了细胞质型Mal-ME基因，Mal-ME在果实发育过程中对苹果酸的积累起负调控作用。 相似文献