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1.
EPSPS (5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EC 2.5.1.19)是植物芳香族氨基酸和植物次生代谢产物生物合成中莽草酸途径的关键酶; 同时也是广谱性除草剂草甘膦的作用目标。本实验通过对草甘膦污染土壤宏基因组文库的建立及筛选, 成功克隆了一个新的草甘膦抗性的EPSPS基因(命名为soilEPSPS)。序列分析表明soilEPSPS基因全长1404 bp, 其编码的467个氨基酸中未涉及已公布专利中保护的氨基酸序列。原核功能验证表明该基因对草甘膦的耐受能力优于EPSPS CP4基因。将该基因与水稻Rubisco SSU引导肽相融合构建由actin启动子驱动的植物表达载体, 用农杆菌介导法实现了水稻的遗传转化。抗性再生植株的PCR和Southern杂交结果表明所获得的26株再生植株均为转基因阳性植株, 其中共有3个单拷贝转化事件。草甘膦抗性鉴定证明纯合体T2代植株能够耐受高达500 mmol L-1的草甘膦。本研究为转基因抗除草剂水稻新品种的培育奠定了基础。 相似文献
2.
挖掘草甘膦抗性基因将有助于抗草甘膦遗传改良作物的培育。本研究分离了一株新型草甘膦抗性菌株肠杆菌20(Enterobacter.E20),该菌株在营养缺陷型培养基中能够耐受高达400 mmol/L草甘膦的胁迫,为充分发掘该菌株在草甘膦抗性方面的利用价值,对该菌株进行了全基因组测序(Gen Bank:CP012999.1)。分离克隆了肠杆菌20其EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)编码基因aroA20(WP_039261572.1),该基因序列长度为1 284 bp,编码427个氨基酸,序列比对分析显示AroA20具有Ⅰ型EPSPS典型的保守结构特征,系统进化分析显示AroA20与大肠杆菌K12的EPSPS具有最近的亲缘关系。利用原核表达系统鉴定了重组aroA20菌株在草甘膦胁迫下的耐受性,在转基因烟草中过表达了aroA20基因并鉴定了转基因植株的草甘膦抗性。研究肠杆菌20与其草甘膦的靶标EPSPS编码基因aroA20在草甘膦抗性上存在差异的分子机制将为深入理解生物体草甘膦抗性奠定研究基础。 相似文献
3.
转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达 总被引：6，自引：0，他引：6
草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4- EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4- EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4- EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花（雄性）生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4- EPSPS基因在（雄性）生殖器官的低效表达。促进CP4- EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。 相似文献
4.
陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析 总被引：4，自引：1，他引：3
5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565 bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。 相似文献
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作物抗草甘膦转基因研究概况 总被引：5，自引：0，他引：5
草甘膦是一种非选择性除草剂,其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键酶。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来,作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展,抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用。对草甘膦作用机理、抗草甘膦基因(EPSPS编码基因)的研究、抗草甘膦作物遗传改良的策略及抗草甘膦转基因作物的推广应用情况进行综述,并简单分析了我国作物抗草甘膦转基因存在的问题及解决途径。 相似文献
6.
抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。 相似文献
7.
为深入研究抗草甘膦水稻突变体osgr-1中编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS的结构与功能,利用生物信息学分析方法对EPSPS基因结构进行分析,对其编码产物功能进行预测。对克隆的EPSPS基因序列分析表明,osgr-1突变体EPSPS基因中CDS序列发生了3个位点的突变,分别为第226位核苷酸残基C变为G,引起编码蛋白226位脯氨酸(Pro)变成丙氨酸(Ala);第301位核苷酸残基G变为T,导致编码产物311位丙氨酸(Ala)变为丝氨酸(Ser);第311位核苷酸残基A变为C,导致编码蛋白中多少位的谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala)。该突变基因编码蛋白含511个aa,Mr为53,823kDa,分子式为C2373H3867N659O721S23,等电点为8.33,为疏水性蛋白,定位于叶绿体上且不存在信号肽;其二级结构中β-转角、α螺旋和无规则卷曲分别占31.6%、17.7%和0.7%;三级结构呈单聚体,由2个亚基组成,有4个氯离子、3个镁离子、1个磷酸根离子的结合位点和2个结构域。 相似文献
8.
转EPSPS基因抗草甘膦棉花的遗传分析 总被引：2，自引：0，他引：2
为分析转基因抗草甘膦棉花早代遗传情况,以花粉管通道法获得的26个转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)抗草甘膦棉花转化事件为材料,以其背景亲本中棉所49为对照,喷施草甘膦后对转基因棉T1、T2分离比例进行考察。T1田间抗性鉴定结果表明,经卡方检测20个转化事件T1分离符合3∶1的分离规律,即外源基因插入1个位点;6个转化事件不符合1对基因的分离规律,出现了偏分离。T2田间抗性鉴定结果表明,通过花粉通管法共获得152个纯合株系,分别来源于25个转化事件;对T2不纯合株系继续进行分离比例的考察,发现来源于15个转化事件的57个株系符合3∶1的分离规律;此外卡方检测结果表明,每个转化事件都有不符合3∶1分离规律的株系,且其中10个转化事件没有符合3∶1分离规律的株系。表明通过花粉管通道法获得的转基因植株中外源基因的整合和遗传均较复杂。 相似文献
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草甘膦生物抗性和生物降解及其转基因研究 总被引：24，自引：0，他引：24
草甘膦(N—phosphonomethyl—glycine，glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl—shikimate—3—phosphate synthase，简称EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程中的一个关键酶。该酶由aroA基因编码。抗草甘膦微生物或植物中EPSP合成酶基因的核苷酸序列在相同或相近位点发生了突变。将编码EPSP合成酶的突变基因导入大豆和烟草等作物中，均能获得转基因的抗草甘膦作物。草甘膦的生物降解途径主要有两条，C-N断裂生成氨甲基磷酸(AMPA)或C-P键断裂生成肌氨酸(sarcosine)，然后两种中间代谢物进一步代谢为磷酸、甘氨酸和二氧化碳等。 相似文献
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《农药市场信息》2013,(22)
<正>近日,上海市农业科学院生物所在源于苹果的抗草甘膦基因的研究方面取得新进展,以院生物所姚泉洪研究员为通讯作者、田永生为第一作者的研究论文"Mutation by DNA shuffling of 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Malus domestica for improved glyphosate resistance"近日被WILEY数据库的植物生物技术著名学术期刊Plant biotechnology journa(l影响因子:6.279)接受。该文首先通过RACE技术从苹果(Malus domestica)中克隆了草甘膦靶酶(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)基因(MdEPSPS),并通过基因重排技术对其进行了改造,获得了一个含有8个氨基酸位点突变的可以耐受60 mM草甘膦的突变基因;然后对其进行了定点回复突变及酶动力学参数测 相似文献
12.
《分子植物育种》2015,(7)
本研究采用常规PCR技术在黄瓜抗白粉病品种JIN5-508中克隆得到几丁质酶基因,并利用荧光定量PCR分析该基因在接种白粉菌后的表达变化。研究结果显示:接菌后几丁质酶基因表达量明显上升,在24 h达到最高值,是其对照的7倍;接菌24 h后,几丁质酶基因表达量迅速下降,最终与对照趋于一致。从具有不同抗白粉病特性的品种中克隆得到几丁质酶基因并进行同源性比对,获得4个多态性位点,对品种间几丁质酶基因开放阅读框(ORF)所编码的氨基酸序列进行了比对,发现了2个氨基酸差异位点,其中抗感白粉病品种在第557个碱基位点即第184个氨基酸位点上存在差异。进一步以抗病品种JIN5-508与感病品种D8杂交得到的F2代为材料,从苗期(2~3片真叶)人工接种白粉菌,1周后根据幼苗发病情况鉴定出F2代中表现为抗病的植株和感病的植株,并以此为材料克隆几丁质酶基因,成功克隆得到F2抗与F2感的几丁质酶基因,发现F2抗性植株中克隆到的几丁质酶基因差异氨基酸位点处的氨基酸与抗病品种一致,而从F2感病株中克隆得到的几丁质酶基因差异氨基酸位点处的氨基酸与感病品种一致。研究结果表明,几丁质酶基因与黄瓜的白粉病抗性密切相关,可利用此差异位点进一步发展与黄瓜白粉病相关的功能性分子标记。 相似文献
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转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。 相似文献
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利用可视化标记建立Cre-loxP介导的抗生素删除载体系统并应用于玉米转基因研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的表达框作为筛选标记基因,命名为pBAC823。在此载体基础上,构建了两个植物表达载体,组成一个抗生素可删除的载体系统。其一是在pBAC823载体Kan基因的一侧加入花青素合成途径中两个转录因子bi基因和cl基因的表达框,命名为pBAC9008。该载体可以作为基础植物表达载体,用于表达目的基因。其二是含Cre酶基因表达框的植物表达载体。将hsp70启动子驱动的cre基因的表达框插入pBAC823载体Kan基因的一侧,并将玉米花青素基因合成途径中转录因子bi和cl的表达框插入多克隆位点,命名为pBAC9009,此载体作为一个删除载体,单独转化植物,之后可以通过杂交方法删除目的基因表达载体中两个loxP位点之间的Kan基因片段。将上述载体转化玉米幼胚,得到T0代转基因玉米的种子,其中部分籽粒为紫色,分子检测结果表明紫色籽粒有花青素基因的插入,验证了花青素合成基因作为可视化标记的可靠性。本研究采用了可视化标记跟踪外源基因的表达和抗生素抗性基因的删除,不仅大大降低了外源基因的检测成本,为转基因食品安全提供技术保证,在转基因研究中具有重要的意义。 相似文献
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水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的克隆及遗传转化 总被引：2，自引：1，他引：1
为了构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的植物表达载体并对其进行遗传转化,以水稻白叶枯病抗性品种‘扎昌龙’(ZCL)的基因组DNA为模板,通过长片段PCR扩增得到水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因Xa31(t)-1和Xa31(t)-2的序列,采用酶切、连接的方法先将目的基因克隆至T载体,筛选正确的质粒后,再克隆至pCMABIA1300表达载体。以农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入‘日本晴’和‘台北309’的愈伤后诱导成苗,获得了大量转基因植株,这些工作为克隆白叶枯病抗性基因并研究其功能奠定了基础。 相似文献
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已糖激酶是植物催化已糖磷酸化生成磷酸已糖的一类重要的酶,参与植物生长发育及信号转导的过程。在前期研究中已从木薯基因组克隆获得7个已糖激酶基因,其中木薯已糖激酶基因MeHXK1主要在叶片、块根韧皮部、雄花和雌花中表达。本研究利用已糖激酶酵母突变菌株YSH7.4-3C鉴定酵母功能,研究已糖激酶是否具有催化已糖磷酸化的作用。结果发现:转pDR195-MeHXK1载体的YSH7.4-3C酵母在以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基中能生长,说明木薯已糖激酶MeHXK1可通过催化己糖磷酸化为酵母的生长提供碳水化合物和能量。这些结果为进一步研究MeHXK1蛋白的酶学特性及生理功能提供参考。 相似文献
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可变剪接是生物体基因在转录过程中存在的普遍现象,该现象是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一,但是在棉花中关于功能基因可变剪接事件的报到相对较少。本文在克隆棉花EPSPS(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase)基因的过程中,发现了该基因的一条可变剪接序列。运用生物信息学的方法研究发现,该序列比正常的EPSPS基因的c DNA序列少152 bp,这造成了终止密码子在该序列的提前出现;正常的EPSPS基因内含子的剪切都遵循常见的"GT-AG"剪切规律,而该可变剪接序列最后一个内含子的剪切是按照"AT-AC"规则进行;该可变剪接序列预测的三维结构模型同正常的EPSPS基因的三维结构存在显著差异。将该可变剪接序列插入到原核表达载体p ET32a,随后将构建好的原核表达重组载体转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)Δaro A,通过在M9基本培养基中的生长研究发现该可变剪接序列不具备正常EPSPS基因所具有的功能。本研究结果丰富了棉花EPSPS基因转录本存在的形式,为深入研究棉花EPSPS基因的转录机制打下了基础。 相似文献
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为了为核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR 鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2-3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR 检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。 相似文献