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1.
棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。 相似文献
2.
通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。 相似文献
3.
基因TBa和TBb分别编码苦荞过敏蛋白的两个亚基,构建这两个基因的表达质粒pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,表达蛋白以包涵体的形式存在。在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠,ELISA检测表明：复性后的蛋白免疫学活性得到了提高。由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法。 相似文献
4.
分析棉花盐胁迫相关的EST文库,设计特异性引物,利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶（ Malate dehydrogenase ,MDH）基因,命名为GhMDH。基因全长1130 bp,最大开放阅读框1014 bp,编码338个氨基酸,分子量为35．495 kDa,等电点pI＝8．94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中,获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白,发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化,结果表明,除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶,其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了得到足够的重组蛋白,对GhMDH包涵体蛋白采用脲素缓冲液溶解,对提取液进行镍亲和层析柱纯化,对洗脱的产物经脲素梯度透析复性。利用生化测定法测定目标蛋白的酶活性,结果表明,克隆的GhMDH基因编码蛋白酶具有脱氢酶活性。以上结果为GhMDH在棉花体内氧化还原动态以及参与抗逆功能等研究提供前提条件。 相似文献
5.
植物Dirigent蛋白认为指导木脂素和木质素的生物合成,同时在生物防御应答,次生代谢调控和病原体抗性的过程中起到了重要的作用。本研究以实验室前期克隆得到杜仲Dirigent1基因(EuDIR1)为基础,利用基因重组技术构建pET-30a-EuDIR1原核表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,在15℃下0.1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,表达模式主要为包涵体。对包涵体进行溶解,使用镍-亚氨基二乙酸亲和层析柱进行纯化。收集纯度较高的洗脱组分进行透析复性,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot鉴定重组蛋白。结果表明,成功构建了pET-30a-EuDIR1原核表达载体,表达菌株诱导后在相对分子质量约18 kD处有1条特异性蛋白条带,包涵体纯化、复性后,经Western Blot鉴定,获得可溶性且纯度较高的重组蛋白。实验中得到的EuDIR1蛋白为体外生化实验提供了科学依据。 相似文献
6.
为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明：IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为：0.2 mmol/L IPTG,37℃诱导4 h;最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。 相似文献
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为获得纯化的BvM14-STPK蛋白激酶，本研究采用低温16℃，0.5 mmol/L IPTG对转BvM14-STPK的大肠杆菌进行诱导，利用Ni2+亲和层析技术对菌液上清进行纯化，并利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测。结果表明37℃，0.5 mmol/L IPTG诱导后，BvM14-STPK蛋白以包涵体形式存在，不能对目的蛋白进行纯化分析研究；通过优化诱导条件，确定在低温16℃，0.5 mmol/L IPTG过夜诱导，在上清中获得大量BvM14-STPK可溶性目的蛋白，对菌液上清纯化并经SDS-PAGE检测到BvM14-STPK目的蛋白。在目的蛋白纯化过程中，发现150 mmol/L咪唑洗脱液纯化BvM14-STPK目的蛋白效果最好。本研究成功纯化出目的蛋白BvM14-STPK。 相似文献
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为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。 相似文献
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《中国农学通报》2019,(3)
为获得纯化的BvM14-STPK蛋白激酶,采用低温16℃,0.5 mmol/L IPTG对转Bv M14-STPK的大肠杆菌进行诱导,利用Ni2+亲和层析技术对菌液上清进行纯化,并利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测。结果表明37℃,0.5 mmol/L IPTG诱导后,BvM14-STPK蛋白以包涵体形式存在,不能对目的蛋白进行纯化分析研究;通过优化诱导条件,在低温16℃,0.5 mmol/L IPTG过夜诱导,在上清中获得大量BvM14-STPK可溶性目的蛋白,对菌液上清纯化并经SDS-PAGE检测到BvM14-STPK目的蛋白。在目的蛋白纯化过程中,发现150 mmol/L咪唑洗脱液纯化BvM14-STPK目的蛋白效果最好。本研究成功纯化出目的蛋白BvM14-STPK。 相似文献
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应用 RT-PCR 技术从鸡法氏囊 B 细胞总 RNA 中克隆出 SIgM λ 轻链基因,并将其进一步克隆于 pET-28a 载体 T7 启动子的下游,构建了 pET-SIgM λ 原核表达载体。转化宿主菌 BL21(DE3),经 IPTG 诱导,成功表达了25.5 kDa 的鸡 SIgM λ 轻链蛋白。经 SDS-PAGE 和 Western-blotting 分析, 表达产物以包涵体形式存在,且能与 His-Taq 单抗特异性反应,为进一步研究 SIgM 的免疫学功能及其他生物学功能奠定基础。 相似文献
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棉花组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与生殖发育密切相关。为了获得大量可溶性表达的GhOTUD5蛋白,本试验对目的蛋白原核表达条件进行优化。采用分子克隆方法构建重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和Transetta(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导目的蛋白表达。在对影响原核表达的四个单因素(菌体密度OD600,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间和诱导温度)分别分析的基础上,设计三水平的正交试验L9(43),摸索大量可溶性目的蛋白表达的最优条件。结果显示,目的蛋白GhOTUD5在Transetta(DE3)中成功表达,在BL21(DE3)中不表达。在菌体密度OD600为0.8、诱导温度为28℃、IPTG终浓度为0.7 mmol/L、诱导3 h的条件下可溶性目的蛋白表达量最高,达到13%左右。该研究结果为进一步研究GhOTUD5在棉花育性方面的功能提供了科学数据。 相似文献
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水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
将水貂阿留申病毒ADV-G株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,鉴定后得到重组质粒pET-VP2a和pET-VP2b,将重组质粒转化到宿主菌BL21中,用IPTG分别以不同浓度,不同诱导时间进行诱导表达,采集样品做SDS-PAGE、Western-blot分析,并以此蛋白作为包被抗原进行ELISA检测。结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,4小时后表达可达到高峰,其大小分别约为23kD和28kD, 该蛋白与ADV阳性血清能发生特异性反应。将此表达产物应用Ni-NTA His-Bind纯化系统进行纯化,其纯度可达到91%,纯化后的蛋白以60μg/孔包被96孔板,检测不同地区水貂血清,同时以对流免疫电泳法（CIEP）为对照,结果发现二者的符合率高达93 %,而应用该蛋白进行检测其反应更为安全,背景低,制备简单,这为今后应用该蛋白作诊断抗原检测水貂阿留申病奠定了基础。 相似文献
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旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。 相似文献
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根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。 相似文献
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番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PL... 相似文献
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为表达纯化出免疫原性良好的牛Inhibin pET32a-matpeptide重组蛋白质,本试验通过对菌液IPTG诱导时间、温度以及诱导浓度的摸索确定了蛋白诱导最佳表达条件,利用重组蛋白小量表达确定目的蛋白以可溶性或包涵体蛋白存在,重组蛋白大量表达纯化出大量目的蛋白,通过Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果表明：使用1MIPTG,18℃诱导表达18h可诱导表达出重组抑制素蛋白,经重组蛋白小量表达确定目的蛋白以可溶性形式存在,Western blog试验表明重组蛋白有较高的免疫原性。本试验诱导表达出可溶性、免疫原性较高的Inhibin pET32a-matpeptide重组蛋白质,为后续制备抗抑制素α亚基抗体奠定了基础。 相似文献
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细胞分裂素在植物生长发育和抵御环境胁迫过程中均扮演着重要的角色,其信号是由细胞分裂素受体组氨酸激酶、组氨酸磷酸转运蛋白(HPs)以及反应调节因子组成的复杂的双元组分系统进行传递的。为了获得高纯度的OsAHP2蛋白,从水稻中扩增了OsAHP2全长cDNA,通过酶切连接的方法构建了2个OsAHP2原核表达载体,命名为pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2,测序正确后分别转化大肠杆菌表达菌株Rosseta和XA90。SDS-PAGE检测结果显示,0.5 mmol/L IPTG诱导1,3,5 h条件下,pET-32a-OsAHP2重组菌株表达出分子量约为35 ku的融合蛋白,pGEX-4T-1-OsAHP2重组菌株表达出分子量约为42 ku的融合蛋白,筛选出融合蛋白表达量较高的pET-32a-OsAHP2进行后续试验。在0.5 mmol/L IPTG诱导3 h条件下,重组大肠杆菌pET-32a-OsAHP2以可溶性蛋白的形式表达OsAHP2融合蛋白,通过His镍离子亲和层析柱纯化后,获得了大量纯度较好的OsAHP2融合蛋白。 相似文献
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基本培养基和蔗糖浓度在大白菜花药培养中对胚状体诱导的影响 总被引：6，自引：0，他引：6
以6个大白菜品种为试材进行花药培养,研究了不同基本培养基和蔗糖浓度对胚状体诱导的影响。结果表明,B5和Keller培养基为适适宜的基本培养基;培养基适宜的蔗糖浓度为8％-12％,最适浓度为10％。 相似文献