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1.
紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。 相似文献
2.
植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。 相似文献
3.
本研究以酿酒葡萄（Vitis vinifera）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）及霞多丽（Chardonnay）为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。 相似文献
4.
玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。 相似文献
5.
通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。 相似文献
6.
花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（... 相似文献
7.
利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟（Loxostege sticticalis L．）中肠cDNA表达文库,得到编码运载蛋白LstiSLC25的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1399bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1kD和9.46。序列含有三个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征。将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得了表达。 相似文献
8.
用RACE技术从西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）中克隆了谷胱甘肽转移酶（PsGSTU1）基因完整编码区 cDNA序列,长度669 bp,编码222个氨基酸。经与谷胱甘肽转移酶家族其它成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定PsGSTU1属于谷胱甘肽转移酶Tau家族。利用荧光定量RT-PCR分析表明,PsGSTU1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,茎中表达量最高,叶和地下茎次之; 3% NaHCO3胁迫后,此基因在叶和茎中的最大表达量出现在胁迫后48 h,而茎在72 h;去胁迫后,此基因在不同部位的表达量表现为：地下茎＞叶＞茎。将PsGSTU1完整的cDNA片段连接至pET28a质粒以构建原核表达载体,并导入大肠杆菌（Escherichia coli）,经IPTG诱导后表达了分子量为26 kD的目的蛋白,表达PsGSTU1的大肠杆菌显著提高了耐受NaHCO3胁迫的能力。 相似文献
9.
甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖. 相似文献
10.
烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达 总被引：9，自引：0，他引：9
应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。 相似文献
11.
摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。 相似文献
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半胱氨酸蛋白酶作为一种重要的水解蛋白酶,参与植物的许多生理过程.采用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria×ananassa)中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP (GenBank登录号:JN979371),该基因cDNA全长1 338 bp,包含一个1 062 bp完整的开放阅读框(ORF),编码354氨基酸.生物信息学序列分析表明,FaCP开放阅读框编码的氨基酸序列与其他植物的CP蛋白同源性较高.Real-time PCR分析发现,FaCP基因在草莓果实、叶、根、茎和花萼中都有表达;在果实成熟过程中FaCP表达量逐渐增加,在粉红果最高,红果中略有下降.在草莓叶片中,随着叶片衰老,FaCP基因表达量增加明显.研究结果表明,FaCP可能参与了调控草莓果实的成熟及叶片衰老. 相似文献
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GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。 相似文献
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猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。 相似文献
15.
电子克隆（in silico cloning）是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。本研究根据物种间同源基因相对保守的特点，利用生物信息学方法以不同物种的基因序列为信息探针，运用Blast软件与所下载的大豆EST数据库进行比对拼接，获得基因全长cDNA序列。首次克隆了大豆天冬氨酸代谢途径上AHRI、AHAS、ASADH、BCAT、CBL、DAPD、DAPE、DHDPR、DHAD、HK和TD等11个关键酶基因的cDNA序列。其中AHRI、DAPD、DAPE、DHDPR和DHAD基因经RT—PCR克隆和序列分析验证，长度分别为1764bp、1467bp、1080bp、1035bp和1806bp，结果与电子克隆序列基本一致。本实验通过与不同物种的这些基因蛋白序列比较，发现与双子叶植物拟南芥、蓖麻和马铃薯的同源性较高，而与单子叶植物水稻的同源性略低。 相似文献
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甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。 相似文献
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番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建 总被引：6，自引：0，他引：6
从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。 相似文献
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花生黄曲霉污染已成为制约我国花生及花生制品出口贸易的关键因素。基于花生抗黄曲霉相关EST序列,RT-PCR法克隆花生ARAhPR10基因（gb｜EU661964.1）,开放读码框471bp,编码157个氨基酸,分子量16.9kD,等电点5.03。与已报导AhPR10（gb｜AY726607）相似性为49.3％。推导氨基酸序列含有PR10家族的高度保守“P-loop”基序（G＊GG＊G）和Betv1保守疏水结构域“GVALP PTAEK ITFET KLVEG PNGGS IGKLT LKY”,推测ARAhPR10是该花生PR10家族的新成员。其基因组扩增序列长度561bp,两个外显子间存在一个长度为87bp的内含子。原核表达ARAhPR10的融合蛋白约25kD,Ni^＋-NTA树脂亲和纯化后获得电泳单一条带。纯化的ARAhPR10融合蛋白具有体外核酸酶活性,预测其具有抗黄曲霉活性。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为ARAhPR10功能研究奠定了基础。 相似文献
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牦牛MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA3’末端全长的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
分别利用基因特异引物YMr-ISP、Ymr-ⅢSP和M13引物M4，通过RT-PCR和3＇-RACE方法从牦牛（Bos grunniens）肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛Metallothionein-I（MT-I）和Metallothionein-Ⅲ（MT-Ⅲ）cDNA3’末端全长序列（分别为331和378bp，GenBank登录MT-I No．AY758557，MT-Ⅲ No．DQ492300），其中分别包含MT-I，基因编码区全长（183bp）、MT-Ⅲ基因编码区全长（207bp），同时在MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA的3’末端具有加尾信号从TAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。分析表明，牦牛MT-I基因编码的MT-I蛋白由61个氨基酸组成，其中20个半胱氨酸（cys）具有保守的三肽结构：C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C等，在分子进化上十分保守；MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成，其中19个Cys除了具有与MT-I以上相同的保守短肽结构外，牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构，在分子进化上亦很保守。这些结构决定了MT-Ⅲ既具有与MT-I相同的重金属解毒等生理功能，又具有区别于MT-I的抑制神经元生长的特异功能。 相似文献
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青稞OMT1基因克隆及原核表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《核农学报》2017,(12)
类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)是一种在植物甲基化黄酮代谢合成中有着重要作用的酶,但在中国青藏高原的特色作物青稞中研究较少。为了更好了解该酶及编码基因在青稞中的生理功能及作用,以高总黄酮青稞品系94-19-1为材料,通过RT-PCR扩增、克隆得到青稞OMT1基因的ORF序列。结果表明,该基因ORF长1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量为38.65 KDa,等电点为5.33。序列比对分析发现,所克隆的基因与NCBI数据库收录的大麦Hv OMT1基因有99.44%的一致性,氨基酸序列存在5个残基差异,编码的蛋白序列具有OMT蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体转化大肠杆菌,最终成功将该基因所编码的蛋白在大肠杆菌诱导表达,并利用亲和层析柱分离技术,将该表达蛋白进行了纯化。这为进一步研究该酶蛋白功能和选育高品质青稞品种奠定了基础。 相似文献