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本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。 相似文献
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PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) 总被引：10，自引：1，他引：10
利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng／μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNV DNA的检出灵敏度为24．8pg,可检出26．6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250．4ng健康虾组织DNA、202．5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病学调查,并具有较高的应用价值。 相似文献
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对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)保守基因序列(AF218226),设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术.将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比.结果显示,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达2个拷贝,比常规PCR灵敏度高1 000倍.对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV阳性的DNA样品进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为2.15×107～4.21×104拷贝/μL.用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测,表明该方法具有良好的重复性,可满足IHHNV的临床诊断需要. 相似文献
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根据G enBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒( IHHNV) 保守基因序列( AF218226), 设计合成了1对引物和1条TaqM an探针, 建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术。将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比。结果显示, 所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达2个拷贝, 比常规PCR 灵敏度高1 000倍。对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV 阳性的DNA 样品进行荧光定量PCR检测, 结果都为阳性, 检测的病毒含量为2. 15 @ 107 ~ 4. 21 @ 104 拷贝/LL。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测, 表明该方法具有良好的重复性, 可满足IHHNV的临床诊断需要。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立 总被引：6，自引：1，他引：6
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大.本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(8.83×103病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应.本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段. 相似文献
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对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV,快速、灵敏、准确,特异性好,可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。 相似文献
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根据偷死野田村病毒(CMNV)的保守基因序列,设计筛选出1对特异性引物CMN279,利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)特异性引物WSS235和IHHN356,建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重PCR检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料,开展特异性测试,该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段,健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段,特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒,应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试,测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74fg、IHHNV7.65fg、CMNV 10fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较,检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验,多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明:本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点,可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。 相似文献
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《福建水产》2021,(4)
传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)作为对虾疾病的主要病原之一,能够感染多种对虾,对幼虾危害尤其明显,虽然死亡率不高,但可以引起对虾生长缓慢,造成巨大的经济损失,严重影响对虾养殖业持续健康发展。本文根据IHHNV病毒基因的保守序列,采用Primer Explorer V4软件设计6条LAMP特异性引物组合,建立了一种以环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)为基础的快速检测IHHNV的方法。对本研究的LAMP检测方法的敏感性和特异性进行分析,并将其灵敏度与实时荧光定量PCR、普通PCR检测方法进行比较。结果显示:LAMP检测方法在63℃恒温条件60 min内完成反应,阳性结果出现可视化的绿色,阴性结果颜色不发生变化;LAMP方法的最低检出限为10.3 copies/μL,灵敏度与荧光实时定量PCR相当,较常规PCR高。结果表明建立的LAMP方法适用于对虾IHHNV的现场快速检测。 相似文献
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采用对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒的特异引物,在一个PCR反应中同时扩增到大小分别为271 bp和356 bp的病毒特异片段,多重PCR条件优化后可从最少100 fg级病毒DNA模板中定性检测出此两种病毒。 相似文献
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为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。... 相似文献
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Studies on the occurrence of infectious myonecrosis virus in pond‐reared Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) in India 
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下载免费PDF全文 A S Sahul Hameed S Abdul Majeed S Vimal N Madan T Rajkumar S Santhoshkumar S Sivakumar 《Journal of fish diseases》2017,40(12):1823-1830
Whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei, with clinical sign of muscle opaqueness with reddish colour at the distal abdominal segments were observed in farms located in West Bengal State, India. The mortality of shrimp in all disease outbreak ponds ranged from 20% to 50%, and mortality increased gradually. The RT‐PCR assay of these samples using primer sets specific to infectious myonecrosis virus (IMNV) revealed its presence in the disease outbreak ponds. The IMNV infection was reproduced in healthy shrimp by intramuscular injection to satisfy River's postulates. The virus caused mortality in intramuscularly challenged shrimp, but failed to cause mortality by oral route. Tissue distribution of IMNV in infected shrimp by RT‐PCR assay revealed the presence of this virus in haemolymph, gill, hepatopancreas and muscle. This study confirms that the disease outbreak which occurred in the shrimp farms located at Purba Medinipur District, West Bengal, India, was due to IMNV. 相似文献
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S. Thamizhvanan S. Sivakumar S. Santhosh Kumar D. Vinoth Kumar S. Suryakodi K. Balaji T. Rajkumar S. Vimal S. Abdul Majeed G. Taju A. S. Sahul Hameed 《Journal of fish diseases》2019,42(3):447-454
White leg shrimp, Penaeus vannamei, were collected on a monthly basis from grow‐out ponds located at Tamil Nadu and Andhra Pradesh states along the east coast of India for screening of viral and other pathogens. Totally 240 shrimp samples randomly collected from 92 farms were screened for white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV), infectious myonecrosis virus (IMNV) and Enterocytozoon hepatopenaei (EHP). The number of shrimp collected from shrimp farms ranged from 6 to 20 based on the body weight of the shrimp. All the shrimp collected from one farm were pooled together for screening for pathogens by PCR assay. Among the samples screened, 28 samples were WSSV‐positive, one positive for IHHNV and 30 samples positive for EHP. Among the positive samples, four samples were found to be positive for both WSSV and EHP, which indicated that the shrimp had multiple infections with WSSV and EHP. This is the first report on the occurrence of multiple infections caused by WSSV and EHP. Multiplex PCR (m‐PCR) protocol was standardized to detect both pathogens simultaneously in single reaction instead of carrying out separate PCR for both pathogens. Using m‐PCR assay, naturally infected shrimp samples collected from field showed two prominent bands of 615 and 510 bp for WSSV and EHP, respectively. 相似文献
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多重RT-PCR体系检测4种虾病毒的方法 总被引：1，自引：1，他引：0
根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV 特异性扩增片段435 bp,IHHNV 特异性扩增片段301 bp 和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0.02和0.2 pg。病毒感染病料检测试验中,该检测体系的检测结果与单纯PCR的检测结果呈现出较好的吻合度。 相似文献
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洪湖碘泡虫PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立一种灵敏、特异的快速检测异育银鲫寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的方法,本研究根据洪湖碘泡虫ITS-5.8S r DNA基因序列筛选出一对特异性引物Mh F/R,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并通过特异性试验、灵敏性试验与临床检测验证其可行性。结果显示,建立的PCR检测方法能特异性扩增洪湖碘泡虫相应的基因片段,长度为479 bp,而对试验中其他9种粘孢子虫的扩增结果均为阴性;最低能检测0.1 pg的虫体基因组DNA。通过临床样品检测,PCR方法比显微镜检测的检出率提高了19.5%。结果表明,该PCR方法特异、灵敏,适用于洪湖碘泡虫的快速检测。 相似文献
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腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。 相似文献