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《分子植物育种》2020,(14)
自噬是一种存在于真核生物中进化保守的分解代谢过程,在植物处于逆境胁迫以及生长发育受阻时起到至关重要的作用。通过水杨酸诱导,从黄瓜中分离出四个自噬基因:ATG8C1、ATG8C2、ATG8F、ATG8C,为揭示这些自噬基因在非生物胁迫下的作用,本研究选取黄瓜幼苗为试材,分别进行以下激素和胁迫处理,并用qRT-PCR检测基因的表达:(1)用10 mmol/L SA和0.2%MeJA滴加叶片进行激素诱导处理,于0 h、6 h、9 h和24 h在滴加的位置取材;(2)用200 mmol/L NaCl进行盐胁迫处理,用20%PEG6000进行干旱胁迫处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶;(3)用黑暗进行碳饥饿处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶。结果表明,在SA和Me JA处理下,黄瓜四个自噬基因都呈现上调表达;在盐和干旱处理下,四个自噬基因的表达有所不同,在黄瓜根和叶中基本呈现上调表达,在茎中多数呈现下调表达。在碳饥饿处理下,四个自噬基因呈现大幅度上调表达。该结果说明在不同的胁迫下,自噬的发生途径有所不同。本研究还利用ExPasy在线工具ProParam和ProtScale分析了四个自噬蛋白的氨基酸、理论分子量和等电点等理化参数,利用MEGA5软件建立了系统进化树,对四个自噬基因进行了初步的生物信息学分析。通过以上试验可以为进一步研究黄瓜自噬基因参与植物抗逆胁迫提供分子生物学的理论基础。 相似文献
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旨在为草地贪夜蛾的预测预报、科学防控、适生性分析以及风险评估提供参考依据。以盆栽香蕉苗、玉米苗和草地贪夜蛾3~4龄幼虫作为试材,用室内接虫和田间自然感虫的方法,测定了选择压力和非选择压力条件下草地贪夜蛾对香蕉和玉米的危害指数、草地贪夜蛾发育历期、幼虫存活率、蛹体大小及成虫羽化率。在非选择压力条件下草地贪夜蛾主要选择危害玉米,对香蕉‘桂蕉6号’只是试探取食,接虫7天后对玉米和香蕉危害指数分别是89.05、1.58。在选择压力下草地贪夜蛾幼虫接虫3天后开始取食危害香蕉,接虫后3、5、7天危害指数分别为11.74、16.51、24.76,说明香蕉不是草地贪夜蛾适宜的寄主作物。取食香蕉的草地贪夜蛾幼虫生长缓慢、虫体小,3龄幼虫至化蛹历时9~14天,比取食玉米的草地贪夜蛾长2~4天;成虫羽化历时9~14天,比取食玉米的草地贪夜蛾长4~7天;取食香蕉明显影响草地贪夜蛾生长发育,幼虫存活率为20.0%、化蛹率68.1%、蛹体大小1.25×0.35 cm、蛹重0.13 g、成虫羽化率47.8%,明显低于取食玉米寄主的幼虫存活率为86.7%、化蛹率97.4%、蛹体大小1.57×0.5 cm、蛹重0.21 g、成虫羽化率92.0%。草地贪夜蛾在选择压力下会取食危害香蕉,危害程度相对较轻,能完成世代生活史,但生长发育速度也较慢。香蕉不是草地贪夜蛾适宜的寄主植物,但在香蕉上暴发存在一定的风险。 相似文献
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细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦1587中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。 相似文献
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细胞自噬是一种进化上高度保守的溶酶体/液泡降解途径,对机体适应各种生物或非生物胁迫,以及维持自身正常生长发育具有重要的意义。自噬相关蛋白8 (autophagy-related protein 8, ATG8)是检测自噬的金标准。目前由于缺乏特异性好的小麦ATG8抗体,导致小麦细胞自噬研究进展缓慢。本研究通过人工合成小麦ATG8蛋白序列上的一段18个氨基酸的多肽作为抗原去免疫兔子,成功获得了高度特异性的小麦ATG8多克隆抗体。该抗体不仅能够识别小麦根、叶及种子中的ATG8蛋白条带,而且可以在根、叶中检测到细胞自噬结构,并首次在小麦籽粒中实现了细胞自噬结构的检测。本研究研制的小麦ATG8抗体,除了能够检测到小麦中常见的ATG8a-h等8种典型类型外,还能检测到一种非典型的新的ATG8蛋白,为深入开展植物细胞自噬调控机制研究以及优异新基因挖掘提供了最佳方法学基础。 相似文献
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本研究旨在评价释放赤眼蜂防治草地贪夜蛾的田间效果,为推广草地贪夜蛾生物防治技术提供参考。分别在南宁市马山县古统村和南宁市西乡塘区坛洛镇金光乳业公司设置1个放蜂区,每个放蜂区安排放蜂试验3次,每次每公顷使用150张蜂卡,每张蜂卡含1000头螟黄赤眼蜂。在放蜂前及每次放蜂后调查草地贪夜蛾为害株率、百株虫量和卵寄生率。3次放蜂后,古统村放蜂区平均为害株率由36.33%降至7.60%,平均百株虫量由11.27头降至3.33头,卵寄生率由20.08%提升至100%,为害情况得到控制,卵寄生率大幅上升;金光乳业公司放蜂区平均为害株率由68.40%升至88.37%,平均百株虫量由43.56头降至43.23头,卵寄生率由0升至3.96%,为害情况未得到改善,卵寄生率有所上升。试验中还发现螟黄赤眼蜂与夜蛾黑卵蜂有协同寄生的情况,古统村放蜂区3次放蜂8天后2蜂共寄卵粒56粒,寄生率为100%。可见玉米田中的夜蛾黑卵蜂和螟黄赤眼蜂偏好共同寄生草地贪夜蛾卵块。综上所述,在田间草地贪夜蛾为害较轻时释放螟黄赤眼蜂,可有效控制草地贪夜蛾田间虫口密度,降低为害率,提高卵寄生率,是防控草地贪夜蛾的有效生物措施之一;田间... 相似文献
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新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。 相似文献
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《华北农学报》2015,(4)
为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ORF1重组病毒样品能够与抗P1 VP1单抗发生特异性反应;电镜观察发现,该蛋白在Sf9细胞中形成了近椭圆形的包涵体。利用杆状病毒表达载体系统成功地在Sf9细胞中表达了类猪圆环病毒P1的ORF1基因,并证实在本试验条件下P1 VP1蛋白不能自组装成VLPs,为进一步研究P1 VP1蛋白的免疫学特性奠定基础。 相似文献
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为了筛选出对草地贪夜蛾高效低毒、环境友好型杀虫剂,以玉米草地贪夜蛾幼虫为实验材料,在2020年和2021年开展了6种药剂防治草地贪夜蛾的田间药效试验。结果表明：18%四唑虫酰胺悬浮剂制剂用量225 mL/hm2、8%甲氨基阿维菌素·虱螨脲悬浮剂制剂用量450 g/hm2、9%甲氨基阿维菌素·茚虫威悬浮剂制剂用量450 g/hm2处理对草地贪夜蛾药后1天的防效为69.52%~81.01%;药后3天的防效达到最高,为90.22%~96.05%,明显优于其他3种药剂。14%氯虫苯甲酰胺·高效氯氟氰菊酯微囊悬浮-悬浮剂制剂用量450 mL/hm2、6%阿维菌素·氯虫苯甲酰胺悬浮剂制剂用量750 mL/hm2处理药后7天防效达到最高,为85.23%~92.74%,明显优于其他药剂。以上5种药剂对草地贪夜蛾均具有较好的防治效果和持效性,防效优于常规药剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐,可在玉米上进行推荐使用。 相似文献
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为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR Green Ⅰ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲线和标准曲线分析等建立实时RT-PCR方法。结果表明,从粘虫中克隆获得EF-1a和AK基因片段长度分别为622 bp和1020 bp,分别编码207个氨基酸和339个氨基酸;序列同源性分析结果表明,粘虫EF-1a与鳞翅目昆虫家蚕、桦尺蠖和柑桔凤蝶的EF-1a氨基酸序列同源性为95%以上;AK与鳞翅目昆虫草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的AK氨基酸序列同源性为98%以上。熔解曲线和标准曲线结果显示,设计的EF-1a和AK基因引物均可应用于实时RT-PCR扩增。 相似文献
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昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用Xba I和Hind III酶切融合片段与pFastBac PH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coli DH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明：通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况,结果证实：感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。 相似文献
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摘要：【目的】规范DCs诱导培养和鉴定的方法,为研究相关病毒致病机制、制定相应的治疗与预防措施奠定技术平台。【方法】分离猪外周血单个核细胞（PBMCs）,贴壁细胞经一定浓度GM-CSF和IL-4诱导,不同时间观察形态变化,7天后收集所诱导的细胞,经光镜、流式细胞术及激光共聚焦显微镜鉴定其形态、表面标志物CD1a/SWC3a;利用双色流式细胞术检测DC MHC-II分子和CD80/86表达情况。【结果】试验结果显示,所诱导的细胞具有典型树突状形态;其表面CD1a/SWC3a双阳性率达到90.1%,MHC-II/CD80/86分子双阳性率达98.3%;激光共聚焦显微镜观察细胞呈集落状,细胞表面CD1a/SWC3a双阳性,表明已经成功诱导出猪血源DC,并获得诱导的标准程序,为研究以DC为靶细胞的猪病毒性疾病免疫致病机理奠定基础。 相似文献
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小麦抗叶锈近等基因系TcLr38 RGAs分析 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：为获得Lr38的抗病类似物质、为今后的相关研究奠定基础,本研究根据已知植物抗病基因的NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)类保守区域设计简并引物,从小麦抗叶锈近等基因系TcLr38中获得了9个小麦抗病基因同源片段D-8、A-5、B-20、C-6、F-16、A-4、B-9、C-4和D-12。这些片段都含有NB-ARC保守结构域,其中D-8、A-5、B-20、C-6、A-4、B-9、C-4和D-12与已知抗病基因的相应区域相一致,具有抗病基因NBS特征结构域激酶2a(Kinase-2)、激酶3a(Kinase-3a)和疏水结构域(HD)。 相似文献
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共表达O型口蹄疫病毒P12A+3C基因的重组杆状病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达。结果表明,表达产物能被O型FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为O型FMDV空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料。 相似文献
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李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。 相似文献
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H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础. 相似文献
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诱导子对茶条槭悬浮细胞核酸酶的激活研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为揭示真菌诱导子诱导茶条槭悬浮细胞发生凋亡的原因,以茶条槭悬浮细胞为材料,采用细胞形态观察、基因组DNA电泳分析以及核酸酶活性检测等手段,研究了真菌诱导子对细胞发生凋亡的影响。结果表明真菌诱导子处理的细胞,其形态结构发生变化,DNA降解成呈梯状的条带,且检测到分子量大约为50、40、41、38、34 kD的核酸酶。通过这些结果说明,茶条槭悬浮细胞在真菌诱导子诱导下发生细胞凋亡,并伴有特异核酸酶被激活。 相似文献
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猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-2、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段.测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程.结果表明,该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点,为猪体内IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA水平的定量检测,提供了必要的技术手段. 相似文献
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T. Nonomura S. Komaki L. Xu N. Moriura H. Ioroi S. Takashima K. Kakutani Y. Takikawa Y. Matsuda H. Toyoda 《Plant Breeding》2009,128(3):282-289
The feedback-insensitive anthranilate synthase (AS) gene was used as a selection marker for transformants of Arabidopsis thaliana . The mutant gene ( mAS1-2 ) was constructed by substituting nucleotide at the effector-binding site of the intrinsic AS gene via PCR-mediated site-directed mutagenesis and flanked with the myrosinase promoter pyk10 to drive its expression during initial root elongation. This inducible gene cassette was first introduced into Agrobacterium tumefaciens and then delivered into A. thaliana by floral-dip inoculation. 5-methyltryptophan (5-MT) inhibited AS and suppressed seedling growth of wild type plants as a result of tryptophan starvation. With the addition of sucrose (10 mg/ml), 5-MT inhibited cotyledon opening and caused anthocyanin to accumulate in juvenile seedlings. The present mutant reversed the tryptophan starvation caused by 5-MT and blocked subsequent sugar responses. The sugar responses were detected in non-transformed plants grown on a selection medium containing 10 mg/ml of sucrose and 10 μg/ml of 5-MT after 3 days of incubation. Thus, true transformants could be selected after a short incubation, compared to the conventional kanamycin-selection method that did not eliminate all non-transformed plants. 相似文献