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【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。 相似文献
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《中国农业科学》2020,(8)
【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。 相似文献
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柑橘类病毒的分子鉴定与分型 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】检测湖南地区柑橘所携带的柑橘类病毒类型,并鉴定柑橘类病毒的亚型。【方法】以田间柑橘枝条韧皮部为试材,提取总RNA,反转录成cDNA,再用不同类型类病毒的特异引物进行PCR扩增,鉴定出各个样品所携带的柑橘类病毒类型;通过测序分析各类型的序列,并与国内外报道的序列进行同源性分析,确定所测样品的亚型。【结果】建立了CEVd、CVdII、CVdⅢ等柑橘类病毒的RT-PCR检测方法。在5个供试样品中检测出3种类型的柑橘类病毒,即柑橘裂皮病类病毒（citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘类病毒Ⅱ型（citrus viriodⅡ,CVdⅡ,又名hop stunt viroid,HSVd）和柑橘类病毒Ⅲ型（citrus viriodⅢ,CVdⅢ）,其中CVdⅡ和CVdⅢ为国内首次发现。亚型分析表明CVdⅡ可能为新的亚型;CVdⅢ为b亚型,可能具有矮化功能。【结论】在中国鉴定出3种类型的柑橘类病毒,CEVd与国内已报道的序列完全一致,其中CVdⅡ和CVdⅢ为首次在中国发现;检测到的CVdⅡ可能为新的亚型。 相似文献
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柑橘主要病毒病的RT-PCR法鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
为建立主要柑橘病毒病准确、快速的分子检测体系,在表现柑橘衰退病（CTV）、柑橘裂皮病（CEV）和柑橘碎叶病（CTLV）典型症状的病树上采叶样提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析．病毒鉴定用的特异引物为CTV3对、CEV2对和CTLV1对．通过不同退火温度的测试,发现所有参试引物均能在56℃退火时扩增出相应的病毒特异带,从而在保证鉴定准确性的前提下,极大地简化了鉴定程序．用建立的RT-PCR体系对云南、重庆、湖南等地有衰退病、裂皮病和碎叶病症状的样品进行检测,结果表明该体系均能对相应病毒进行准确检测． 相似文献
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【目的】病程相关基因非表达子1（non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1）是水杨酸（salicylic acid,SA）介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚（Citrus paradisi）中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙（C. sinensis）抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）,统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量;同时,收集接种Xcc后0、3和5 d接种部位的叶片,利用实时荧光定量 PCR分析SA和JA分别介导的防御反应相关基因CsPR1和CsPDF1.2在Xcc诱导下表达水平的变化;根据CiNPR4蛋白与TGA转录因子相互作用网络预测CiNPR4互作蛋白为Ciclev10005080m和Ciclev10001081m,以甜橙为参考基因组,将这两个基因在https://www.citrusgenomedb.org/网站上进行blastx分析,预测CiNPR4在甜橙基因组中互作的候选蛋白,克隆CiNPR4和候选蛋白基因的cDNA,利用同源重组法分别构建诱饵载体和猎物载体,并将诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母菌株Y2HGold中,进行点对点酵母双杂交分析。【结果】CiNPR4的超量表达减轻了转基因柑橘叶片上溃疡病的症状,柑橘溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片上Xcc的生长比较缓慢,在接种Xcc后9 d,转基因植株Xcc数量显著低于野生型（wild type,WT）晚锦橙;Xcc诱导0 d,溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株含有与WT植株无差异的SA含量,随着Xcc诱导时间的延长,CiNPR4转基因植株中SA的含量显著增加;而Xcc处理0 d时,WT植株含有显著高于CiNPR4转基因植株的JA含量,随后,JA含量在CiNPR4转基因植株中逐步上升,Xcc处理5 d时,达到显著高于WT植株的水平;而WT植株在整个处理期间SA和JA的含量基本保持不变;溃疡病抗性增强的转基因植株受Xcc诱导3 d时CsPR1的表达水平迅速上升,达到与WT植株差异显著的水平,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升;WT植株受Xcc诱导后CsPR1的表达水平没有发生显著变化,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升,且显著高于CiNPR4转基因植株中CsPDF1.2的表达水平;酵母双杂交分析证实,CiNPR4与甜橙基因组中的CsTGA2转录因子互作。【结论】CiNPR4与CsTGA2转录因子互作,通过促进SA而抑制JA介导的防御反应,调控转基因柑橘对溃疡病的抗性。 相似文献
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利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus,CLBV）中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上,以CLBV中国分离物（CLBV-HBYD）全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY,该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定（GenBank登录号：MG572236）,其基因组全长8 747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％-98％,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6 软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。 相似文献
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辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白（coat protein,CP）和圆柱状内含体蛋白（cytoplasmic inclusion protein,CI）保守区域分别设计引物,筛选两个基因（CP和CI）的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2 μL、CP337-F/CP337-R各0.625 μL（10 μmol·L-1）、CI655-F/CI655-R各1.375 μL（10 μmol·L-1）、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。 相似文献
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【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）TaqMan实时荧光定量（RT-qPCR）检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品（粪便样品39份,肠道样品44份）进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×101拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份（22份粪便样品,9份肠道样品）检出率为37.3%（31/83）,显著高于普通PCR检测结果（检出率12.0%（10/83））。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。 相似文献
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【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。 相似文献
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【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR3... 相似文献
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【背景】柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的细菌性病害,可侵染枝、叶、果,危害几乎所有的柑橘主栽品种。前期对湖南省39个柑橘园的调查结果显示柑橘果园土壤酸化和交换性钙缺乏严重,叶片中均存在钙缺乏现象。钙是植物所需大量元素之一,钙缺乏会造成植物营养失衡,生长势下降,植物免疫水平受影响。然而,钙元素对柑橘溃疡病抗性的影响尚不明确。【目的】分析对柑橘溃疡病敏感的枳(Poncirus trifoliata)在不同钙浓度处理下叶片注射接种Xcc后的致病差异,探讨钙在Xcc侵染枳叶片过程中的作用。【方法】采用沙培法对枳实生苗进行0、0.75、3、30 mmol·L-1钙浓度处理,分别测定枳生长期的生物量、叶绿素a和b浓度、根系和叶片钙元素含量、观察根系活性氧(ROS)的产生和胼胝质沉积,并分析枳叶片接种Xcc后细胞壁合成相关基因及免疫途径相关基因诱导表达变化特征。【结果】以3 mmol·L-1钙处理为对照,0、0.75和30 mmol·L-1钙处理后,... 相似文献
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背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。 相似文献
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【目的】活性氧（reactive oxygen species,ROS）是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘（甜橙）CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析植物激素水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员（CsRboh01—CsRboh07）,其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点（PI）分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域（NADPH_Ox）、铁还原酶跨膜组件（Ferric_reduct）、FAD结合结构域（FAD_binding）和铁还原酶NAD结合结构域（NAD_binding）4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。 相似文献
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GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白（Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973）可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。 相似文献