共查询到16条相似文献，搜索用时 671 毫秒
1.
【目的】生长素输出载体蛋白（PIN-FORMED,PIN）是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据。【方法】根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株。转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异。qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异。以0.05 μmol·L-1的萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid,NAA）处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响。【结果】在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T0代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体。序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失。qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制。幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化。NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育。 相似文献
2.
【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g -1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g -1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。 相似文献
3.
4.
【目的】 为了丰富和加深人们对植物叶色形成的分子机理认识,对水稻黄绿叶突变体ygl3（yellow green leaf 3）进行表型鉴定和基因克隆,阐明YGL3的分子功能,为解析YGL3调控水稻叶色形成的分子机理奠定基础。【方法】 从水稻中花11 CRISPR-Cas9敲除突变体库中鉴定出2份稳定遗传的等位黄绿叶突变体,命名为ygl3-1与ygl3-2,对突变体的表型进行鉴定,测定野生型和突变体苗期的叶绿素含量,运用透射电镜观察野生型和突变体ygl3的叶绿体结构。利用实时荧光定量PCR分析YGL3的组织表达模式,并使用BioXM 2.6软件对YGL3及其同源蛋白序列进行比对,采用酵母双杂交方法筛选YGL3的互作蛋白。【结果】 在苗期,与野生型相比,突变体ygl3叶片黄化,叶绿素、类胡萝卜素和总光合色素含量显著降低。透射电镜结果表明,突变体ygl3叶绿体形态异常,类囊体片层结构较少,而野生型叶绿体形态正常,类囊体片层结构排列有序。CRISPR-Cas9敲除位点鉴定结果表明,LOC_Os01g73450发生单碱基插入,导致蛋白翻译提前终止,该基因编码351个氨基酸的蛋白突变为55个氨基酸的截短蛋白。与野生型相比,LOC_Os01g73450的表达水平在突变体中显著下调。qRT-PCR结果表明YGL3在水稻根、穗、种子、叶鞘以及叶片中均有表达,且叶片中表达水平最高。YGL3编码一个质体定位的尿嘧啶核苷酸激酶。蛋白氨基酸序列比对表明YGL3蛋白在玉米、高粱、拟南芥等物种中均较为保守,与拟南芥同源蛋白氨基酸的同源性为59.4%。qRT-PCR结果表明,叶绿素合成基因（如HEMC、HEME和URO-D）在突变体ygl3中显著下调,而HEMB、HEMF和HEML等叶绿素合成基因在野生型与突变体之间无显著差异。酵母双杂交系统筛选水稻叶片酵母cDNA文库,发现YGL3与RNA编辑因子MORF8存在互作。【结论】 水稻黄绿叶突变体ygl3的表型是由LOC_Os01g73450突变导致,该基因与已报道的水稻黄绿叶基因YL2/YGL8等位。YGL3在叶片中高度表达,同时YGL3与MORF8在酵母中互作。 相似文献
5.
【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle（ESP）,分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F2定位群体,挑选与突变表型一致的F2单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO（gene ontology）聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F2定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著（差异>1.5倍）的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。 相似文献
6.
7.
【目的】OsRRK1（rop-interacting receptor-like kinase 1）属于胞质类受体激酶RLCK Ⅵ家族成员,通过对OE-OsRRK1转基因水稻的叶片形态观察,明确OsRRK1在水稻叶片发育中的作用。【方法】依据水稻基因组数据库公布的目标序列设计引物并构建OsRRK1超量表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化转入到粳稻品种合江19,通过PCR分析鉴定阳性植株,Southern blot鉴定转基因植株插入外源基因的拷贝数,Northern blot杂交和qRT-PCR鉴定转基因植株在RNA水平的表达情况;选取T2代纯合植株抽穗期的剑叶进行叶片卷曲指数（leaf rolling index,LRI）测定;通过石蜡切片和苯胺蓝染色观察水稻横切后泡状细胞的变化情况,用Image J软件统计泡状细胞的面积;采用叶绿素测定计测量植株叶片叶绿素含量。【结果】共获得OE-OsRRK1转基因阳性植株44株,随机选取17株,经Southern blot鉴定8株为单拷贝株系,9株为多拷贝株系;随机选取2份多拷贝株系（OE-1和OE-4）和5份单拷贝株系（OE-5、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25）用于后续试验。经分析发现OsRRK1在不同的转基因株系中具有不同程度的过表达情况,其中OE-1、OE-4和OE-25株系超量表达程度高,OE-5株系超量表达程度低,OE-21、OE-22和OE-24株系超量表达程度居中。从中选取OE-5、OE-22和OE-25共3份单拷贝转基因株系和WT对照经Northern blot鉴定后与qRT-PCR结果一致。统计选取的7个株系和WT对照的叶片卷曲指数发现：卷曲程度与OsRRK1表达量呈正相关,表达量越高卷曲程度越高。水稻叶片经切片和染色后发现OE-OsRRK1转基因植株叶片中泡状细胞发生了明显变化,转基因株系中泡状细胞数目都小于对照中泡状细胞均值4.6个。叶片卷曲得越明显,泡状细胞退化得越严重,数目更少,面积更小。经叶绿素含量测定发现,OE-22、OE-24和OE-25转基因的水稻叶片的叶绿素含量比野生型水稻叶片叶绿素含量高。【结论】过量表达OsRRK1会影响泡状细胞的数目和面积,从而使水稻叶片发生卷曲,且卷曲程度与表达量呈正相关;OsRRK1在水稻中的过量表达导致叶绿素含量增高。 相似文献
8.
蔗糖转运蛋白又称蔗糖-质子共转运蛋白,简称SUT(sucrose transporter)或者SUC(sucrose carriers),主要担负植物光合产物——蔗糖的跨膜运输与分配调控,在植物体内完成使蔗糖从“源”到“库”的运输。采用CTAB法提取杉木总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,设计基因特异性引物,从1年生无性系杉木幼苗嫩叶中克隆SUT基因,并利用生物信息学方法分析SUT的基本结构、进化关系、理化性质。结果表明,在电泳图上总RNA的结构完整,28 S的亮度约为18 S的2倍;A260/A280为2.20,A260/A230为2.31;杉木SUT基因编码区全长为1 782 bp,共编码593个氨基酸,是具有SUT基因家族的典型12个跨膜区;通过系统进化树的分析发现,杉木SUT与无油樟SUT的亲缘性较高,SUT蛋白属于疏水性蛋白。 相似文献
9.
采用人工染色体(TAC)多基因组装载体系统,将一组与水稻光合同化物运输转化有关基因构建在同一载体上,这些基因分别是蔗糖转运蛋白基因(OsSUT5),单糖转运蛋白(OsMST4)、细胞壁转化酶(OsCIN3)和ATP/ADP转运蛋白(OAAT),获得了包含这4个基因的植物表达载体pTAC747H-OAAT-SUT5-CIN3-MST4,质粒大小近30 kb。通过农杆菌转化法,将基因导入水稻,以探讨这些基因对水稻光合同化物运输和转化的调控作用。 相似文献
10.
【背景】植物花粉外围包裹的花粉外壁作为植物雄性配子的天然保护屏障对植物的生殖发育起到非常重要的作用。植物花粉外壁的主要成分是孢粉素,主要由脂类物质和酚类物质构成。因此,脂类物质和酚类物质的代谢是植物花药内外壁形成和花粉外壁形成的关键步骤。在其合成过程中,PKS1/PKSA/LAP6和PKS2/PKSB/LAP5在不同物种间发挥保守的生化功能。【目的】通过研究水稻OsPKS1和OsPKS2在花药内外壁和花粉外壁发育过程中的作用,为水稻花药内外壁和花粉外壁合成机理提供新认识。【方法】水稻花药发育基因共表达网络AntherNet预测到一个可能参与孢粉素合成的基因OsPKS1,利用CRISPR/Cas9技术在野生型9522背景和突变体ospks2背景下敲除OsPKS1获得ospks1单突变体和ospks1 ospks2双突变体。在同一生长条件下比较野生型和突变体植株表型,分析突变体植株的营养生长和花器官发育情况。通过I2-KI染色分析ospks1和ospks1 ospks2的花粉活力。通过半薄切片观察野生型和突变体各个时期花药四层细胞发育及小孢子发育,利用扫描电子显微镜观察野生型和突变体花药外壁、花药内壁和花粉外壁表面的精细结构,利用透射电子显微镜观察野生型和突变体花药壁细胞、花粉外壁和乌氏体的精细结构。【结果】获得4个ospks1单突变体和4个ospks1 ospks2双突变体,其中,ospks1-3是纯合的单突变体,ospks1-4 ospks2是纯合的双突变体。ospks1-3和ospks1-4 ospks2均呈现雄性不育的表型。ospks1-3与ospks2的花粉外壁和乌氏体结构均不正常,但两者结构不同。ospks1-3花药表面可形成凸起的外壁结构;绒毡层可正常降解。花粉外壁内部形成大量微小的空洞,柱状体变短,无法有效连接覆盖层和花粉外壁内层;乌氏体的底部结构减小,顶部结构增多,并且较野生型更为尖锐。ospks1-4 ospks2花药外壁角质层减少;绒毡层无法正常降解。小孢子表面无花粉外壁,在11期降解;乌氏体在9期形态异常,数目变少,到11期从绒毡层脱落。【结论】PKS1/PKSA/LAP6和PKS2/PKSB/LAP5的功能在多个物种间均保守,可以影响孢粉素的合成和堆积。但在水稻中两者对于花粉外壁内部结构身碎骨和乌式体形成的功能不同：OsPKS1对柱状层的形成以及乌氏体的底部结构形成更为重要;而OsPKS2对于覆盖层的形成以及乌氏体的顶部结构更为重要。两者互相补充,共同调控花粉外壁、花药外壁的形成和绒毡层的降解。 相似文献
11.
【目的】研究水稻HD-ZipⅠ转录因子家族的成员OsHOX6基因启动子的表达。【方法】通过构建水稻OsHOX6基因启动子与GUS基因融合表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium)介导,以未成熟水稻胚作为试验材料,转化到水稻IR64,通过PCR检测和潮霉素抗性筛选出阳性的转基因植株,从不同组织取样品,进行X-Gluc染色并观察。【结果】转基因植株的叶、根、茎、花等器官经过X-Gluc染色后,主要在侧根、花粉以及组织损伤部分出现蓝色斑点,其它组织均未检测出蓝色斑点,观察根解剖结构,绿色斑点集中在根内皮层。【结论】 水稻OsHOX6基因启动子能够驱动GUS基因,在转基因水稻侧根和花粉上特异表达。 相似文献
12.
【目的】 抽穗期是水稻重要的农艺性状,适时抽穗是确保水稻产量和区域适应性的关键因素。然而,水稻抽穗期调控的基因及其调控网络仍需进一步研究。已知FCS-like锌指蛋白是植物特有且在植物生长发育和逆境响应过程中发挥重要作用的蛋白家族,但其调控植物开花的功能未知。研究OsFLZs在调控水稻抽穗期中的功能,有助于完善水稻抽穗期调控网络,同时为抽穗期遗传育种提供新的理论基础和基因资源。【方法】 根据RGAP数据库公布的基因序列,构建OsFLZ18的过量表达载体和CRISPR-Cas9敲除载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法转化日本晴愈伤组织,从而获得相应的水稻转基因植株;利用PCR技术筛选并鉴定OsFLZ18敲除纯合株系;在水稻生长过程中,调查过量表达、敲除植株和日本晴植株的抽穗时间;采用qRT-PCR方法分析OsFLZ18的时空表达模式,昼夜节律性以及OsFLZ18对抽穗期调控基因表达的影响;通过酵母双杂交试验验证OsFLZ18与调控水稻抽穗期关键因子的相互作用。【结果】 OsFLZ18的表达无明显组织特异性,在14 d的幼苗中表达量最高,其次是分蘖期的叶鞘和叶片,以及生殖生长阶段的茎和幼穗;成功构建了OsFLZ18-CRISPR载体,并转入粳稻日本晴中,筛选并鉴定获得2个CRISPR敲除纯合突变体。采用表达量较高的2个OE植株（OE-2和OE-3）以及纯合的敲除植株（CRISPR-21和CRISPR-25）进行抽穗期表型观察。结果发现,在广州自然短日照和自然长日照条件下,OE植株均出现明显的晚花表型,但是CRISPR敲除植株的抽穗时间较野生型无明显差异。qRT-PCR结果表明,在人工短日照条件下,与野生型相比,OE-2植株中Ehd1、Hd3a、RFT1的表达量明显被抑制,但Hd1的表达量没有明显的变化。酵母双杂交试验表明OsFLZ18和正向调控水稻抽穗期的转录因子OsMADS51存在互作。同时,OsFLZ18的表达量存在昼夜节律性,在白天表达量低,夜晚表达量高,并在半夜达到最高值。【结论】 过量表达OsFLZ18可以导致水稻延迟抽穗。 相似文献
13.
【目的】小穗是禾本科植物特有的花器官。在水稻中，小穗作为花序的基本单位和独有结构，对水稻的产量和品质具有重要影响。因此，研究水稻小穗和花器官的发育，为水稻产量和品质的形成提供依据。【方法】使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变籼稻保持系西农1B，获得2个具有相似突变表型的水稻等位突变体polarity defect of lateral organs 2-1和polarity defect of lateral organs 2-2(pdl2-1和pdl2-2）。由于二者表型相似，选取pdl2-1（命名为pdl2）为材料，通过显微观察和石蜡切片技术分析其小穗突变表型；通过农艺性状考察分析小穗外稃突变对水稻产量的影响；通过图位克隆技术验证PDL2的功能；运用原位杂交技术及实时荧光定量PCR(RT-qPCR）技术分析PDL2的表达模式。【结果】表型分析结果表明，与野生型相比，pdl2突变体外稃明显变窄，不能与内稃紧密钩合，导致小穗开裂，内轮花器官部分裸露在外，但其雄蕊、雌蕊和浆片的形态和数量均表现正常。进一步的石蜡切片结果表明，突变体外稃硅化细胞和泡... 相似文献
14.
[目的]观察水稻MS5同源基因OsMS5-1/OsMS5-2双突变体的形态特征,为进一步研究水稻MS5同源基因OsMS5-1、OsMS5-2在水稻雄性育性中的功能提供参考.[方法]以前期通过RNAi干扰技术创制的两个水稻MS5同源基因OsMS5-1、OsMS5-2的粳稻中花1 1干扰单突变体T1代为亲本,将其进行正反杂交以创制双突变体,以野生型粳稻中花11成熟花粉粒为参照,对双突变体的花粉粒进行碘—碘化钾染色及电镜扫描观察.[结果]正反交双突变体的花粉粒均未被染色,呈细小、不规则、透明状,其不育度可达100%,而正常可育的野生型花粉粒被染为深蓝色,呈较大而规则的正圆形.双突变体的花粉粒存在发育缺陷,其外形、萌发孔和花粉粒外壁均明显不同于正常可育的野生型中花11的花粉粒.[结论]水稻OsMS5-1及OsMS5-2基因双突变体花粉粒形态特征与野生型可育花粉粒存在一定差异,但两种双突变体不育花粉粒总体上差别不明显,可作为鉴别早期不育与可育花粉的重要指标. 相似文献
15.
【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】 选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系（over-expression,OE）-1（OE-1）、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L -1 NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L -1 NaCl处理3 d后苗长及根长;用150 mmol·L -1 NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride,NBT）染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。 【结果】 谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L -1NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L -1 NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O 2-和H2O2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。 【结论】 谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。 相似文献
16.
【目的】由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是我国油菜种植上的主要问题,严重威胁着菜籽产量及品质。分泌性蛋白在病原菌致病过程中起着重要作用,核盘菌基因组中包含大量编码分泌性蛋白的基因,本研究旨在鉴定并筛选与致病性相关的分泌蛋白基因,揭示核盘菌的致病机理,为菌核病防控提供重要靶标。【方法】采用SMART软件对核盘菌在侵染抗病、感病甘蓝过程中差异表达明显的8个具有信号肽的候选基因进行蛋白质结构域的分析,随后将SMART分析得到的结构域分别于SCOP、Pfam、PDB数据库进行功能注释。利用基因特异性引物进行目的基因特异片段的PCR扩增,构建pTRV2-Gene和pTRV2-GFP载体。随后等量混合含有pTRV1及pTRV2-Gene,pTRV1及pTRV2-GFP载体的重悬菌液。室温静置3 h后,利用针筒浸润法将pTRV2-Gene载体及对照（TRV-GFP）侵染5—6周龄的本氏烟（Nicotiana benthamiana）。侵染植株于黑暗环境中培养48 h后,再置于正常光照条件的环境中生长7 d。将直径6 mm的核盘菌PDA菌丝块接种于侵染9 d后的烟草叶片叶腹的中央,其中带菌面紧贴叶片,随后将接种植株培养48 h后统计病斑面积。提取接种48 h后的病斑及病斑周围组织叶片（距腐烂组织边缘1 cm左右）的RNA,利用特异引物进行目的基因的qRT-PCR,计算目的基因在携带TRV-HIGS载体的烟草植株中的相对表达量。【结果】SMART及结构域注释预测这8个候选基因可能参与了蛋白、核酸或多糖的水解,影响植物的免疫反应,参与核盘菌对药物耐受性的调节及生物素合成。核盘菌接种携带这8个基因的TRV-HIGS载体及对照载体的烟草,48 h后对照植株的病斑面积平均为3.44 cm 2,除SS1G_07655外,其余7个候选基因的TRV-HIGS植株上的病斑面积相比对照植株均显著减小（P≤0.05）,其病斑面积介于1.63—2.61 cm 2。qRT-PCR结果显示,这7个致病相关的候选基因在核盘菌侵染烟草过程中的基因表达水平均显著低于对照（P≤0.05）。【结论】利用TRV介导的HIGS技术成功地对核盘菌中8个未知功能的分泌蛋白基因进行了功能鉴定,筛选到7个可能与核盘菌致病性相关的基因,其中对核盘菌致病性影响最大的SS1G_03146预测可能参与核盘菌生物素合成,同时SS1G_04343及SS1G_11912预测可能参与影响植物的免疫反应。 相似文献