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多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。 相似文献
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应用RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草 总被引：1，自引：0，他引：1
RNA沉默是迄今最为有效的抗病毒策略,利用该策略不但能获得免疫转基因植株,且所得植株不易与其他病毒基因重组或异源包壳、生物安全性较高。将本实验室已构建的携带有烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因(ΔRep)反向重复结构的植物表达载体pBIN438-MP-Rep(i/r),用农杆菌浸润法转化普通烟草品种K326,共得196株转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测发现128株为阳性转基因株;PCR-Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到烟草基因组并在转录水平上得到表达;ELISA结果显示20.3%的转基因植株对CMV和TMV复合侵染表现免疫性。本结果为利用RNA沉默技术进行植物抗多种病毒育种提供重要数据,为防治其他多种病毒复合侵染提供借鉴。 相似文献
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以13个基因型小麦的幼胚愈伤和新春9号幼胚为受体材料,利用农杆菌菌株C58C1(含有GUS外源基因)进行侵染,通过组织化学染色的方法统计GUS基因瞬时表达率,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型及适宜的菌液浓度和侵染时间,优化农杆菌转化的条件,为逐步建立小麦农杆菌的转化体系奠定基础.结果显示,不同基因型小麦GUS瞬时表达率在0～95.9％之间,其中新春9号、小偃328和济麦19的GUS基因瞬时表达率均在90％以上;对新鲜幼胚和预培养7d的幼胚愈伤组织分别侵染30 min和60 min,前者GUS阳性率均为0,后者分别为92.0％和95.9％,说明预培养可以显著提高受体材料对农杆菌的敏感性,提高转化效率;在不同菌液浓度(OD600=0.5、1.0、1.5)侵染时,GUS基因瞬时表达率分别为93.4％、94.0％和87.6％,不同侵染时间(15,30,60 min)下,GUS基因瞬时表达率分别为94.6％、92.0％和95.9％.综合考虑认为,适宜的小麦农杆菌转化条件为幼胚经过4～7 d预培养,在菌液浓度OD600=1.0时进行15 min的侵染. 相似文献
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GhCPS基因沉默对棉花幼苗生长和内源激素含量的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
利用RT-PCR从棉花中获得493 bp的GhCPS(赤霉素(GA)合成酶基因)片段,经EcoRⅠ/KpnI双酶切后连入pTRV-RNA2质粒,获得了重组载体pTRV-GhCPS;用该载体转化农杆菌后,室内盆栽条件下侵染棉花品种欣抗4的子叶苗。结果表明,病毒诱导沉默GhCPS基因的棉花幼苗中GhCPS的表达量仅为空载体对照的52%。与空载体对照相比,沉默GhCPS的棉花幼苗第1叶和第2叶的内源GA4含量分别降低33%和60%;第2叶ABA含量降低48%,IAA、ZR和iPA含量均无显著变化;株高降低64%。第1叶和第2叶的叶面积分别减小26%和47%,总叶绿素含量分别增加29%和63%,类胡萝卜素含量分别增加27%和46%。第1叶的净光合速率、气孔导度、胞间CO2和蒸腾速率分别增加23%、40%、9%和31%。可见,利用病毒诱导基因沉默技术技术沉默GhCPS后可调控棉花幼苗叶片内源激素平衡,控制棉花幼苗的生长,并提高单位叶面积的光合能力。 相似文献
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影响农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化番茄主要因子的研究 总被引：1，自引：1，他引：1
LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一,位于合成代谢的重要分支点上,直接影响β-胡萝卜素的合成.以番茄子叶、茎段作为转化受体,通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物番茄,对影响转化的几个因素进行了研究.结果表明,转化受体经预培养比未预培养有利于农杆菌的侵染转化;侵染时间子叶以10min、茎段以15min为宜;农杆菌菌液浓度OD600以0.7为佳;添加AS可提高抗性愈伤的诱导率,S的添加以100μmol/L效果较好;延迟筛选有利于提高抗性愈伤诱导率. 相似文献
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喜树是一种具有药用价值的木本植物,其主要次级代谢产物喜树碱具有良好的抗癌功效。本研究主要通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术对喜树碱生物合成途径中的关键酶基因CaCYC1环烯醚萜合酶(Camptotheca acuminata iridoid synthase,CaCYC1)进行瞬时沉默,进而研究该基因对喜树碱生物合成的影响。以喜树叶片总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆CaCYC1基因片段并构建TRV-VIGS重组质粒,转化农杆菌GV3101后侵染喜树叶片,培养20 d后利用qRT-PCR与HPLC技术分析沉默对CaCYC1基因转录水平及喜树碱合成的影响。结果表明:与对照组相比,实验组中CaCYC1基因的相对表达量显著下降49%,叶片中喜树碱的积累量显著下降35%。上述结果表明,本研究所构建的由TRV介导的VIGS体系可有效沉默内源基因的表达,CaCYC1基因可正向调控喜树叶片中喜树碱的生物合成。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)是依赖于RNA干扰(RNA interference, RNAi)快速降解靶标基因分析其功能的一种技术,RNAi属于植物天然防御机制的一部分。与其他植物基因功能验证方法相比,VIGS技术操作简单、见效快、无需转基因。番茄是中国乃至世界重要大宗蔬菜,也是现代蔬菜的主导产业,自从番茄基因组测序完成,逐步成为果实类基因功能研究中的模式植物,本研究归纳总结了近年来VIGS技术在番茄基因功能中研究与应用,以期为茄科蔬菜乃至园艺植株基因功能研究提供参考与借鉴,为加速蔬菜乃至园艺作物基因功能研究提供参考。 相似文献
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为研究烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术应用的广谱性,以陆地棉(Gossypium hirsutum)CLA1为标记基因,通过构建基因沉默载体,在新陆早33和亚洲棉(Gossypium arboreum)建立了TRV-VIGS体系。半定量PCR分析表明,与对照相比,TRV侵染的新陆早33和亚洲棉中CLA1基因的表达均被有效抑制,真叶表现出明显的白化症状。同时在45份新陆中系列棉花材料中重复该体系,并且通过控制培养温度来检验温度对VIGS的影响,结果表明,当昼/夜温度分别为23℃/21℃和32℃/28℃时,不同品种的新陆中系列棉花均可以维持不同程度的白化表型。证明,TRV介导的VIGS可以用于室内研究新陆中系列棉花和亚洲棉基因功能。 相似文献
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基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T0代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T0代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T1代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。 相似文献
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bHLH转录因子对植物生长发育、形态调控有重要作用, 为了研究BoLH27基因在甘蓝叶片发育及形态建成中的调控功能, 本文以甘蓝品种519为材料, 克隆出转录因子BoLH27基因。序列分析表明, 该基因含有一个795 bp的开放阅读框, 编码264个氨基酸, 具有一个保守的典型bHLH结构域。以农杆菌介导的遗传转化方法将正义BoLH27基因导入甘蓝品种519中以增强表达, 通过PCR筛选出9株T0代转基因单株, 结合T2代单株的qRT-PCR分析表明, 筛选的转基因植株内BoLH27基因的表达积累量明显高于野生型。试验基地隔离网内种植的转基因甘蓝表型明显, 主要表现为莲座期茎叶间距拉长、叶柄伸长以及植株茎和叶柄显示紫色, 植株叶片平展, 无向上向内卷曲趋势, 表明BoLH27基因可能对甘蓝叶片发育有重要的调控作用。 相似文献
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黄籽油菜具有种皮薄、出油率高等优点, 研究油菜黄籽的形成具有重要的意义。前期研究表明, TTG1 (TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)基因参与了油菜种皮颜色的形成。本研究利用发根农杆菌A4菌株诱导了芥菜型油菜四川黄籽的毛状根, 并研究了菌液浓度和外植体部位对诱导率的影响。结果表明, 菌液浓度OD值为0.8时, 诱导效率最高, 平均为71.5%; 外植体中下胚轴的发根率最高, 平均为87.3%。在四川黄籽毛状根中过表达TTG1基因, 发现原花色素合成途径中的DFR (dihydroflavonol4-reductase)、ANS (anthocyanidin synthase)和BAN (anthocyanidin reductase)基因的表达受到抑制。本研究优化了油菜毛状根的诱导体系, 为利用毛状根体系进行基因功能验证提供了新的思路和方法。 相似文献
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旨在研究羊踯躅八氢番茄红素脱氢酶基因的功能,为其花瓣着色的分子机理研究提供一定的理论依据。以羊踯躅瓣为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣cDNA中克隆获得到2098 bp的八氢番茄红素脱氢酶基因cDNA序列,命名为RmPDS。序列分析表明,RmPDS基因包含一个长度为1743 bp编码580个氨基酸的开放阅读框。利用NCBI分析该基因的氨基酸序列,Blast序列分析结果显示RmPDS与其他植物PDS蛋白氨基酸的相似性达到87.80%。用MEGA软件构建系统进化树,结果显示羊踯躅PDS与茶树PDS蛋白的亲缘关系最近。荧光定量PCR检测结果表明RmPDS基因在羊踯躅花蕾期和膨大期表达量较低,在初花期表达量最高,盛花期表达量有所降低。RmPDS基因参与羊踯躅花色的形成,研究结果为进一步探究该基因在花色形成中的作用机制奠定基础,同时也为构建杜鹃VIGS体系提供报告基因。 相似文献
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水稻温敏型叶色突变体是研究植物光合作用、叶绿体结构和功能以及温度影响叶绿体发育的理想材料。利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼型水稻(OryzasativaL.)三系保持系西农1B,从其后代中筛选到一个突变性状稳定遗传的温敏型叶片白化转绿突变体tsa2 (temperature-sensitive green-revertible albino 2)。与野生型相比, tsa2突变表型受温度影响, 22°C条件下萌发的野生型幼苗表型正常,而tsa2幼苗完全白化,且约40%白化苗死亡,存活白化苗的光合色素含量、光合速率均显著降低,成熟期主要农艺性状均显著变劣;在28°C下萌发的tsa2幼苗叶片呈浅绿色并伴有白条纹,其光合色素含量显著降低,光合速率及主要农艺性状差异较小; 32°C下萌发的tsa2幼苗叶片无明显差异。透射电镜观察显示,与野生型相比,tsa2在22°C下叶肉细胞中无叶绿体或存在异常发育叶绿体(尚未分化出基粒和基层),在28°C下部分叶肉细胞含少量发育完整的叶绿体,在32°C下叶肉细胞数量及形态均正常。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,与野生型相比,tsa2突变体中部分光合色素代谢途径基因、叶绿体发育相关基因及光合作用相关基因的表达水平呈不同程度变化。遗传分析表明, tsa2突变表型受一对隐性核基因控制, TSA2被定位于第5染色体SSR标记S5-57和S5-119之间,物理距离为718 kb。本研究为水稻遗传改良及研究温度影响叶绿体发育机制奠定了基础。 相似文献
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烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）寄主范围广泛、传染性极强,严重影响作物的产量和品质。实验室前期在不同耐受 TMV侵染的烟草品种中筛选出1个表达显著差异的蛋白14-3-3-like C,在此基础上,对Nt14-3-3-like C基因进行了克隆、生物信息学分析和亚细胞定位;通过农杆菌介导遗传转化,获取转基因植株;通过qPCR对转基因植株中TMV侵染响应相关基因的表达进行分析。结果显示,14-3-3-like C蛋白序列长度为780bp,编码260个氨基酸,具有14-3-3蛋白的典型沟槽结构,但没有跨膜结构和信号肽;定位于细胞核和细胞膜;转基因材料的qPCR分析发现,在Nt14-3-3-like C基因抑制的植株中,病原防卫和光合途径相关的基因表达显著下降,表明Nt14-3-3-like C可能通过抑制病原防卫和光合途径相关基因表达参与TMV对烟草的侵染。 相似文献
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转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K+/Na+差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。 相似文献
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本研究利用病毒诱导基因沉默技术对转Bt基因棉花选择标记基因nptⅡ进行沉默,分析标记基因转录后沉默的可行性。以烟草脆裂病毒载体为骨架构建nptⅡRNAi载体,利用农杆菌浸染棉花子叶,获得nptⅡ干涉的转Bt基因棉花植株,然后涂抹卡那霉素进行检测。结果表明nptⅡ沉默植株叶片出现黄斑症状,RT-PCR和q RT-PCR检测表明叶片、根和茎中nptⅡ基因转录分别被抑制了99.25%、99.05%和98.65%,沉默后期的转录抑制也达到98%。本研究结果为解决已经在环境中释放转基因生物发生意外扩散和不可预料的生物安全事件提供了快速有效的应对方法和新思路。 相似文献