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1.
以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建 总被引：1，自引：2，他引：1
通过基因工程手段抑制脂肪酸延长酶基因fae1的表达,以阻止芥酸合成,培育不受高芥酸窜粉影响的低芥酸品种.利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物和多聚酶链式反应(PCR)从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的12个不同品种中扩增出长1007bp的fae1基因片段,通过对fae1基因片段DNA序列的测定和序列比较,找到长度为428bp高度保守区作为RNA干涉(RNAi)的靶标区.根据RNA干涉(RNAi)双向表达载体设计原则,将428bp fae1基因片段以正反两个方向插入双向表达载体pMCG161中,两个片段用一个wax基因的内含子连接,植物筛选标记基因采用bar基因,从而构建以油菜fae1基因为靶标的RNAi载体. 相似文献
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本研究以弄岛野茶（MHLC）和云抗10号（YK10）茶树品种为实验材料,通过HPLC测定不同样品不同季节以及MHLC不同发育阶段叶和茎的生物碱含量;利用RT-PCR法克隆不同样品中的咖啡碱合成酶基因1(TCS1)的编码区,并对其表达量进行分析。结果显示：MHLC是一份天然低咖啡碱、高可可碱茶树种质资源,不同季节其可可碱含量均大于23.00 mg/g,而咖啡碱的含量不足4.00 mg/g;另外,MHLC芽中积累的咖啡碱和可可碱最高,在同一发育阶段下,叶片比茎具有更高的咖啡碱和可可碱,并且随着成熟度的提高,叶片和茎中的咖啡碱和可可碱均逐渐减少。通过基因克隆和定量分析发现：MHLC具有2种TCS1等位变异：TCS1b（仅具有可可碱合成酶活性）和TCS1d（同时具有可可碱和咖啡碱合成酶活性）,其中TCS1b的高表达、TCS1d的极低表达很可能是导致MHLC高可可碱、低咖啡碱的关键原因。本研究为低咖啡碱茶树育种提供材料,也为MHLC的有效利用提供分子基础。 相似文献
3.
根据KCS基因的保守性设计引物,以高神经酸含量的碎米荠叶片DNA为模板(KCS基因无内含子),克隆碎米荠超长链脂肪酸合成的限速酶β-酮脂酰- CoA合酶(KCS)基因全长CDS序列,命名为CarKCS.Blast 比对及序列分析表明,目的片段序列和GenBank上报道的拟南芥KCS18序列同源性达到87％.CarKCS全长1518bp,不含内含子,编码505个氨基酸.生物信息学分析表明,所有的酶功能活性位点的氨基酸都存在,在N端都有两个,C端有一个高度疏水的跨膜结构域;CarKCS与KCS18同属于KCS基因家族的FAE1 - like亚家族.将目的片段连接到pFCC -5941.nap表达载体,经PCR和酶切检测,证明已成功构建了pNapin- CarKCS载体. 相似文献
4.
根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。 相似文献
5.
以玉米基因组DNA为模板,通过LA-PCR技术扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并将其克隆到pMD18-TVector上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析并测序。结果表明,该启动子和Genbank中发表的玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%,克隆片段长为934bp。再将经BamHⅠ和HindⅢ双酶切得到的启动子片段克隆到相同酶酶切的pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb,并进行酶切鉴定和PCR检测。结果显示,启动子基因sbeⅡb已成功整合到植物表达载体pBI121上。序列中发现高等植物启动子所特有的基本核心序列和种子特异表达所需的特殊调控元件。 相似文献
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构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。 相似文献
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本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。 相似文献
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茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。 相似文献
12.
选取低硫苷低芥酸含量的甘蓝型油菜品种“湘油15号”和“Westar”,高硫苷高芥酸含量的甘蓝型油菜品系“GX-272”和“GX29”,利用农杆菌介导法,以pFGC5941为目标载体,分别对其进行遗传转化。以磷化麦黄酮（PPT）作为筛选剂,分别对4个油菜品种（系）的子叶柄分化率和转化率进行统计。结果表明,双低油菜“湘油15号”、“Westar”的子叶柄分化率高于高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”;而高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”的转化率则高于双低油菜“湘油15号”、“Westar”。初步认为种子中硫苷和芥酸含量对甘蓝型油菜子叶柄遗传转化的分化率和转化率有一定影响。 相似文献
13.
普洱茶渥堆发酵中可降解咖啡碱真菌菌株的筛选和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了在普洱茶渥堆发酵中筛选出可降解咖啡碱的菌株,采用咖啡碱液体筛选培养基从不同阶段普洱茶发酵样中筛选目标菌株,结合菌落特征、分生孢子结构以及18 S r DNA序列对目标菌株进行鉴定。并将目标菌株接种至茶叶内进行单菌种发酵,通过高效液相色谱法(HPLC)测定咖啡碱、茶碱、可可碱、3-甲基黄嘌呤等嘌呤碱含量。结果表明,在普洱茶发酵样中筛选出一株有效降解咖啡碱的菌株,此菌株在48 h内对咖啡碱的降解率为87.7%。经鉴定为聚多曲霉(Aspergillus sydowii),序列相似性为99.8%。在聚多曲霉茶叶单菌种发酵中,咖啡碱含量急剧下降,在发酵结束时仅占干物质重的(0.414±0.077)%;茶碱质量分数大幅度上升,由最初的不足0.1%上升至(2.129±0.246)%,成为主要的嘌呤碱;可可碱含量无显著变化(P0.05);3-甲基黄嘌呤有大幅度增加,增幅达130%。本文首次从发酵茶叶中筛选出可降解咖啡碱的菌株,探究了微生物发酵中咖啡碱的转化产物,为低咖啡碱普洱茶的开发提供了菌种。 相似文献
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为探究微生物作用下咖啡碱的降解产物与途径,将普洱茶发酵中筛选鉴定的Aspergillus sydowii NRRL250（聚多曲霉）、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株分别接种至晒青毛茶进行单菌种固态发酵,并采用高效液相色谱（HPLC）测定咖啡碱、可可碱、茶碱的含量,探究微生物对咖啡碱代谢的影响;另外,基于UHPLC-QTOF-MS代谢组学技术,以灭菌处理组（ST组）和原料组（RM组）为对照,对聚多曲霉接种发酵样进行代谢组学分析。结果表明,A. pallidofulvus NRRL4789、A. sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株对咖啡碱等嘌呤类碱代谢均无显著影响,而在聚多曲霉接种发酵中,咖啡碱含量显著下降（P<0.05）,降幅达83.89%;茶碱含量显著增加（P<0.05）,发酵末期含量为(25.03±1.17) mg·g-1;而可可碱保持基本稳定。由此可知,聚多曲霉对咖啡碱降解代谢有显著影响。采用UHPLC-QTOF-MS方法检出茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤等9种与咖啡碱降解相关的代谢物。在聚多曲霉作用下,茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤含量显著提高（P<0.05）。茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤和1-甲基黄嘌呤与咖啡碱及其相关代谢物的N-脱甲基化途径相关。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸与咖啡碱相关代谢物的氧化途径相关。由此可知,聚多曲霉为降解普洱茶咖啡碱的优势菌株,且具有将咖啡碱转化为茶碱的潜在能力;在咖啡碱降解代谢过程中,存在聚多曲霉作用下的N-脱甲基化和氧化,并以N-脱甲基化为主。 相似文献
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油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建 总被引：8，自引：1，他引：8
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%.根据RNA 干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2. 相似文献
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基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1 及转基因油菜的获得 总被引：2，自引：0，他引：2
通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。 相似文献
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光照敏感型新梢白化茶新品种‘御金香’春梢化学成分研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用HLPC法检测了光照敏感型新梢白化茶品种‘御金香’春梢生物碱、儿茶素类、氨基酸类和光合色素类化合物含量,并以温度敏感型新梢白化茶品种‘白叶1号’和常规茶树品种‘福鼎大白茶’为对照。结果显示,‘御金香’咖啡碱和可可碱含量显著高于‘福鼎大白茶’和‘白叶1号’;儿茶素类总含量显著低于‘福鼎大白茶’和‘白叶1号。光照敏感新梢白化茶‘御金香’和温度敏感型新梢白化茶‘白叶1号’的氨基酸含量显著高于‘福鼎大白茶’,但叶绿素a和叶绿素b、β-胡萝卜素、黄体素和新黄质等光合色素含量显著低于‘福鼎大白茶’。‘御金香’呈现黄色叶片的白化现象主要是因为叶绿素含量低,而并非类胡萝卜素含量高所致。 相似文献
19.
Eteng MU Eyong EU Eka OU Umoh IB Ebong PE Ettarh RR 《Plant foods for human nutrition (Dordrecht, Netherlands)》1999,54(4):337-344
Caffeine and theobromine contents (mg/g) weredetermined in samples of selected Nigerian beverageproducts. The beverages were cocoa (Milo, Bournvita,Rosevita and Enervita), coffee (Nescafe, Bongo, and Maxwell House decaffeinated) and tea (Lipton). The theobromine contentsof samples of Milo, Bournvita, Rosevita, Enervita, Nescafe, Bongo, Maxwell Housedecaffeinated coffee and Lipton were 62.10 ± 5.21, 64.80 ± 6.72, 82.80 ± 4.43, 80.37 ± 6.80, 27.00 ± 4.31, 14.67 ± 2.90, 23.46 ± 3.13 and 12.60 ± 1.52 respectively. The corresponding caffeine contents of these samples were 2.78 ± 0.43 (Milo), 3.17 ± 0.36 (Bournvita), 0.92 ± 0.51 (Rosevita), 1.05 ± 0.68 (Enervita),93.66 ± 8.91 (Nescafe), 6.47 ± 2.42(Bongo), 37.22 ± 5.34 (Lipton), and 0.21 ± 0.11 (Maxwell House decaffeinatedcoffee). Semi-processed cocoa beverages (Rosevita and Enervita) had significantly (p < 0.05) higher levels oftheobromine compared with the finished cocoas (Milo and Bournvita). Similarly, Nescafe contained significantly (p < 0.05) higher levels of caffeinecompared to Maxwell House (decaffeinated coffee) and Bongo. Levels of caffeine in Lipton tea were moderate. 相似文献