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CRISPR/Cas9基因编辑系统是作物分子设计育种的重要手段,sgRNA设计对于提高基因编辑效率具有重要作用.为了提高sgRNA设计的准确度,构建了聚乙烯亚胺修饰的单壁碳纳米管(PEI-SWNT)介导的瞬时转化体系,并用于检测青花菜CRISPR/Cas9基因编辑效率.结果表明,CRISPR/Cas9编辑体系可以诱导青花菜特定基因位点发生突变,编辑效率为8.3％.研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制青花菜新种质提供了基础. 相似文献
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为明晰我国农作物基因编辑育种创新链的角色地位，从技术创新价值链视角出发，从知识原理、应用技术和产品开发3个维度系统梳理分析了全球基因编辑育种创新链的演化逻辑和最新发展态势。结果表明:1)全球大多数研发资源主要集中在中间环节的应用技术开发和种质资源创制上，处在创新链末端的商业化运用产品相对较少，尤其在我国还没有商业化的基因编辑品种面世。2)对基因编辑的进一步原理性知识创新的空间十分有限。基因编辑作为一种普及的技术手段，未来创新的重点在于利用基因编辑工具创制具有新功能的育种材料和种质资源。3)商业化产品开发目前是基因编辑创新链中最薄弱的环节，且只有开发出能满足市场需求，具有重大社会经济效益的基因编辑成果才有意义。本研究进一步提出了我国建立高效运转的基因编辑农作物育种创新体系和准确定位发展目标的对策建议，为构建具有中国特色的创新价值链提供决策参考。 相似文献
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【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。 相似文献
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CD163双等位基因编辑猪的制备及传代 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F1代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F1代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。 相似文献
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【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术遗传改良水稻种质,创制高直链淀粉新材料。【方法】以水稻品种中花11为试验材料,利用CRISPR/Cas9编辑系统对水稻淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）基因OsSBE3进行靶向编辑,利用PCR技术鉴定无标记纯合突变体,并测定其淀粉含量。【结果】T0代获得10株突变体株系,T1代获得5个无标记纯合突变株系,其中4个株系（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。【结论】本研究创制了高直链淀粉含量的水稻新种质,为水稻品质改良提供了参考。 相似文献
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《福建农业学报》2020,(5)
【目的】利用基因编辑技术编辑水稻香味基因,改良优质粳稻香味性状。【方法】构建CRISPR/Cas9-BADH基因编辑载体,转化优质粳稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134,测序鉴定3个优质粳稻品种的香味基因Betaine aldehyde dehydrogenase 2(Badh2)突变体并分析潜在脱靶效应,利用气相色谱-质谱联用技术测定不同遗传背景badh2突变体稻米的2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline, 2AP)含量。【结果】转化获得的30株T_0代中有24株为badh2突变体,其中53.33%为杂合型突变,16.67%为纯合型突变,10%为双等位突变类型。T_1代非转基因植株内共鉴定获得7种纯合badh2突变基因型。在5个预测位置上未检测到脱靶事件的发生,说明设计的sgRNA具有高度特异性。所有Badh2移码突变体稻米的2AP含量都达到或高于稻花香的水平,但不同品种来源的badh2突变体间2AP含量差异极显著。【结论】本研究提供了一个能够高效诱导水稻Badh2突变的CRISPR/Cas9定向编辑靶点,改良了生产上大面积推广的3个优质水稻品种龙稻18、龙稻24和秀水134的香味性状,发现了不同遗传背景的水稻badh2突变体间2AP含量差异显著,为基于定向编辑Badh2基因的方法培育适合生产应用的香稻品种、提高育种效率提供科学依据。 相似文献
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本文综述了隐性雄性核不育水稻的产生,基础理论和利用研究现状.认为产生核不育水稻的途径有四条,即自然突变、理化诱变、组织培养和人工杂交选育.大多数核不育水稻不育性遗传表现隐性单基因性状,表现两对基因性状或更为复杂的情况则较少.核不育水稻一般具有各自的不育位点,很少等位.根据等位性测定结果,目前核不育基因已超过45个.核不育水稻的利用主要体现在近年兴起的用于轮回选择的育种方法上.鉴于国内光敏核不育水稻研究,对有关问题进行了讨论. 相似文献
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本文对新发现的陆地棉狭薄卷苞叶突变体苏BM009进行了遗传研究.狭薄卷苞叶突变性状的遗传受一对隐性基因控制;等位性测验表明:狭薄卷苞叶基因与窄卷苞叶基因fg是非等位的,是一个新鉴定的基因,暂定名为fb;连锁测验结果表明:fb基因与R1、L20、R2、Y1、P1、Lc1、N1等7个标记基因没有连锁关系,而与H2(茎杆多茸毛)标记基因可能存在连锁关系.本文对狭薄卷苞叶突变性状的育种利用价值进行了客观的评价,并对其在原棉品级改良以及提高病虫害防治效果方面进行了讨论. 相似文献
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基因组编辑技术及其安全管理 总被引：5，自引：0，他引：5
基因组编辑技术利用核酸酶对生物体内的DNA双链进行断裂,并以非同源末端连接或同源重组的方式对基因组DNA特定位点进行突变、缺失或者基因的插入与替换。锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、成簇规律间隔短回文重复序列是目前基因组编辑技术应用中的3种关键核酸酶。基因组编辑技术已在植物基因功能、育种等领域广泛应用,特别是基于成簇规律间隔短回文重复序列的基因编辑技术CRISPR-Cas9。具有优良性状的基因组编辑大豆、玉米等产品已逐步从实验室走向田间,基因组编辑作物展现了较传统转基因作物更为优越的应用前景。本文简要概述了主要使用的3种基因组编辑技术及其原理。对这些技术的优缺点进行了分析,并依据物种分类梳理了利用上述3种技术在动物、植物中突变体建立、基因功能研究、分子育种等方面的研究进展。同时,针对基因编辑产物的产业化应用前景,讨论了基因编辑技术及其产品较传统转基因技术产品的优势,分析了基因编辑技术及其产品可能因脱靶效应而引发的生物安全风险,介绍了美国、欧盟等国家对基因编辑技术及其产品安全管理和商业化应用的政策。文章结合中国现行法规对转基因生物的定义及安全评价(实质等同、个案分析)原则,讨论了基因编辑技术及其产品的安全管理,初步提出了基于传统转基因生物安全评价框架的基因编辑产品的安全评价和管理思路。针对基因编辑产品需要按照个案原则进行评价和管理,安全评价重点开展分子特征及食用安全评价;同时需要针对基因编辑技术的特点建立更加有效、特异的检测新方法,实现对基因编辑产品的有效监测,以促进基因组编辑产品的商业化应用。 相似文献
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水稻是重要的粮食作物之一,在盐碱地开发和改良中发挥着重要作用。为了创制高耐盐水稻种质资源,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种盐丰47中对OsRR22设计3个靶位点进行基因编辑。通过PCR和测序鉴定,在T0代获得16个突变单株,其中靶位点1和靶位点2均有纯合突变,靶位点3没有检测到突变。在T1代转基因株系中,获得3株纯合突变且无T-DNA插入的纯合突变体。对T2代进行农艺性状分析发现,与野生型相比,突变体的株高显著降低,产量相关农艺性状均无显著变化。苗期耐盐性鉴定结果表明,在200 mmol/L NaCl处理7天后,突变株的存活率比野生型提高30%以上。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种盐丰47进行了耐盐性改良,为耐盐水稻新品种的培育提供了理论和材料基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经逐渐成熟并在多种植物中得到成功应用,促进了基因功能的研究。小麦籽粒硬度是决定小麦加工品质的重要性状,Pinb是控制籽粒硬度的关键基因之一。本研究以小麦Pinb基因为对象,联合采用常规PCR和Golden Gate cloning技术,构建了包含小麦Pinb基因启动子区双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。将重组载体转入小麦原生质体中进行sgRNA活性的检测,在两个靶点位置均发生了突变,编辑效率分别为4. 57%和4. 37%,基因编辑类型包括碱基替换和碱基缺失。该研究为在小麦中实现Pinb基因的定点突变奠定了基础,对其功能研究和小麦品质改良均具有重要意义。 相似文献
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《山东农业科学》2019,(10):8-13
基因编辑技术为植物基因功能研究和作物遗传改良提供了有效途径。目前基因编辑植株基因分型多采用PCR/RE法、PAGE检测法、Sanger测序法等手段,但这些方法存在操作复杂、耗时长或成本高等问题。PARMS技术(penta-primer amplification refractory mutation system,五引物扩增受阻突变体系)是最新开发出的基于荧光检测的SNP基因分型方法,具有操作简便、耗时短、成本低的优势。本研究利用PARMS技术对水稻CRISPR/Cas9基因编辑植株进行了基因分型,鉴定结果与PAGE检测和Sanger测序法一致,证明PARMS技术可用于水稻基因编辑植株后代基因分型,也为其它作物基因编辑后代基因分型技术选择提供了参考。 相似文献
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【目的】利用TALEN技术定向突变水稻pms3的原始突变区域,创制不同类型osa-smR5864小RNA编码序列突变体,鉴定不同突变体的雄性育性光温反应变化规律,为基于定向编辑水稻PMS3基因的方法培育水稻两系不育系材料提供科学依据。【方法】构建基因编辑载体TALEN-PMS3,转化日本晴和明恢86,通过测序鉴定pms3突变体,利用福州夏季自然长日高温鉴定T2代pms3突变体的雄性育性及自交结实率。【结果】转化获得25个转基因T0代克隆,其中日本晴有4个克隆产生了突变,明恢86有5个克隆产生了突变,突变率分别为40.0%和33.3%。在T1代非转基因材料中,日本晴背景中有3种纯合突变类型,明恢86中有5种纯合突变类型。在福州夏季自然长日高温条件下,T2代pms3突变体能够产生正常可育的花粉,自交结实率正常,并未表现出类似培矮64S的光温敏雄性不育特征。【结论】本研究通过基因编辑获得的多种类型水稻pms3突变体并不能产生光温敏雄性核不育表型,说明了pms3位点调控水稻光温敏核不育性分子机制的复杂性。 相似文献
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猪在农业和医学领域均具有重要应用价值,利用基因修饰技术能够快速提高猪的经济性状和培育
人类疾病动物模型。CRISPR/Cas9 基因编辑技术具有操作简单、高效和低成本的优势,在猪基因修饰领域具有重
要应用。但 CRISPR/Cas9 易引发基因组结构不稳、大范围染色体重排和基因脱靶等问题,因而具有潜在的生物
安全风险。近年基于 CRISPR/Cas9 开发的碱基编辑技术可以实现单个碱基定向转换,不会导致 DNA 双链断裂,
理论上不会引发插入 / 缺失（Indels）,对基因编辑更精准、更安全。随着碱基编辑工具的不断开发和改良,其
不仅能产生 C → T（A → G）突变,还能产生 C、A 两种碱基的同时突变以及 C → G 突变,增加了应用范围;改
良的碱基编辑工具在保持编辑效率的同时能够降低甚至消除旁侧突变、非 C → T（A → G）突变以及 Indels,使
得碱基编辑技术在猪遗传修饰上具有更加重要的潜在应用价值。综述了不同的碱基编辑系统原理、碱基编辑技
术在基因修饰猪模型构建和猪遗传改良中的应用,以及碱基编辑系统在猪成纤维细胞中的编辑效率和脱靶情况,
以期为开展猪碱基编辑应用实践提供参考。 相似文献