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1.
对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化.结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8 mg/L,37℃2h后4℃过夜,1％ BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1:4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5 min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9％.该方法可用于临床样品的大批量检测. 相似文献
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对重组原核表达载体pETN的表达条件进行了优化，在最佳诱导条件下获得了猪生殖与呼吸综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)。利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行了纯化，再分别用SDS—PAGE电泳及Western—blotting试验对纯化产物的纯化效果及特异性进行了检测。结果表明，纯化产物的纯度可达95％以上，并具有良好的免疫学反应活性。 相似文献
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鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用鸡传染性支气管炎M41株病毒研制了检测鸡传染性支气管炎抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为0．973ug／ml，被检血清最佳稀释度为1：200，酶标结合物最适工作浓度1：1200，血清样品阴阳性临界值为0．184。本试剂盒和Aflfinitech的IB试剂盒同时检测56份血清样品，比较结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为100％和88％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存6个月。 相似文献
4.
本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。 相似文献
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本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化.通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10μg/mL,血清的最佳稀释度为1:160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1:1000,血清及二抗的最佳反应条件为37℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37℃反应10 min,cutoff值为0.25.通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性.与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%.结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测. 相似文献
6.
猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用 总被引：3，自引：2，他引：1
本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1∶1000,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37 ℃反应10 min,cutoff值为0.25。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%。结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测。 相似文献
7.
利用新城疫Clone30株病毒研制了检测新城疫抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为1．086μg／ml，被检血清最佳稀释度为1：100，酶标结合物最佳工作浓度1：800，血清样品阴阳性临界值为0．34。本试剂盒和HIPRA的ND试剂盒检测64份血清相比较，结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为90％和93．2％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存3个月。 相似文献
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【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D450 nm值≥0.365时,判定为阳性;当D450 nm值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 相似文献
10.
为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。 相似文献