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1.
以Kpn I和XhoI双酶切带有CitSERK基因cDNA全序列的T/A克隆载体,同时以Kpn I和XhoI双酶切PMV载体,凝胶回收目的基因片段及PMV载体骨架片段,成功构建了CitSERK基因正义与反义表达载体,并对遗传转化载体构建体系进行了优化。结果表明:以Kpn I和XhoI双酶切带有CitSERK基因的T/A克隆载体和PMV载体,成功得到带有Kpn I和XhoI双酶切位点的目的基因片段和PMV载体骨架片段;酶切检测结果显示,阳性克隆成功酶切出预期大小的CitSERK基因片段和PMV载体骨架片段;2对特异引物PCR检测结果显示,阳性克隆同时扩增出预期大小的CitSERK基因片段。 相似文献
2.
根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
3.
Bt基因的克隆及植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。 相似文献
4.
[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。 相似文献
5.
成功构建了单链抗体hs83基因植物表达载体pCAMBIA1301-hs83。首先根据基因的序列重新设计了两条含有合适酶切位点的引物,酶切位点保证了基因能够插入取代pCAMBIA1301上GUS基因的第二外显子;第二步是PCR反应克隆目的基因,然后连接到pMD-18T载体,进行测序鉴定;第三步是对pCAMBIA1301质粒和T-hs83质粒进行双酶切,释放出两个目的片段,分别回收后连接,酶切鉴定后将重组子通过冻融法转化根癌农杆菌EHA105,并用PCR法进行鉴定。 相似文献
6.
[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。 相似文献
7.
[目的]构建重组人表皮生长因子的植物用表达载体,为应用花生毛状根表达系统表达人表皮生长因子(hEGF)奠定基础。[方法]在GenBank中找到hEGF基因序列,并人工合成;将含hEGF基因与绿色荧光蛋白(GFP)的基因连接,用加相应接头的引物扩增得到这2个基因的片段,然后用Sal I和EcoR I的进行双酶切并回收;提取质粒pRI 101 AN DNA,并用Sal I和EcoR I对其进行双酶切并回收,再次将经过双酶切的2个DNA片段连接,将连接产物转化大肠杆菌XL10-Gold,再提取得到的发荧光重组子质粒的DNA,用酶切图谱和PCR进行鉴定,将验证正确的重组子中的质粒DNA命名为pBZG101。[结果]hEGF和GFP连接成功,并成功地将这2个基因连接的片段连接至质粒pRI 101 AN DNA上,得到了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。[结论]该研究成功构建了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。 相似文献
8.
[目的]以小鼠基因组为模板克隆乳清酸蛋白(whey acidic protein gene,WAP)5′和3′调控区,并构建人乳铁蛋白(Human Lactoferrin,hLTF)乳腺特异性表达载体。[方法]以高保真PCR技术扩增WAP5′和WAP3′长度分别为3.5 kb和4.6 kb的DNA片段,并克隆测序,应用体外连接技术连接pcDNA3.0、WAP5′、WAP3′和hLTF,转化连接产物,以限制性内切酶酶切、PCR验证和琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。[结果]内切酶酶切及PCR鉴定结果显示,WAP5′和WAP3′基因克隆成功,其hLTF乳腺特异性表达载体构建正确。[结论]成功克隆WAP5′和WAP3′调控区;成功构建了hLTF乳腺特异性表达载体pW2-hLTF。 相似文献
9.
[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。 相似文献
10.
用从德国引进的抗线虫基因Hs1pro-1构建表达载体并转化大豆,以获得抗线虫转基因植株.提取克隆载体p1832,用Nco 酶切、Klenow补平和Sac 酶切,回收基因片段;提取表达载体pBI121,用Sma 和Sac 酶切,回收大片段;目的片段用T4DNA连接酶连接并转化E.coli,鉴定重组质粒;用基因枪轰击转化大豆品种早熟1号,获得18株再生苗,其中3株经PCR检测呈阳性,通过Southern杂交,证明Hs1pro-1基因已整合到其中2株大豆的基因组中. 相似文献
11.
目的：构建以庆大霉素为筛选标志的新载体PG18mob。方法：首先用酶BglII、BstBI切质粒Pk18mob,割胶回收2948bp片段;其次采用PCR技术扩增出庆大霉素抗性基因826bp片段;将扩增出的片段插入回收的2948bp片段中以构建新质粒;最后以IPTG和庆大霉素筛选阳性转化株并PCR和酶切验证。结果：验证结果显示庆大霉素抗性基因确实插入了回收的2948bp片段中。结论：成功构建了以庆大霉素为筛选标志的新载体PG18mob。 相似文献
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为提高紫花苜蓿的抗根腐病性能,采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,双酶切重组MsChi-pMD18-T质粒和表达载体PCAMBIA1302后,将MsChiⅠ基因与线性表达载体PCAMBIA1302进行定向连接,通过酶切和PCR验证MsChi-pCAMBIA1302载体构建正确性.采用快速冻融法,将表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404中,转化烟草植株,对转化后的烟草植株进行PCR和RT-PCR检测.结果表明:成功构建Ⅰ类几丁质酶基因MsChiⅠ的植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,转化获得6株烟草转基因植株,目的基因已经成功整合到烟草的基因组中. 相似文献
14.
[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。 相似文献
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酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建与转化 总被引：2，自引：0，他引：2
以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出大约1．5kb的片段．PCR产物经回收后，与Pc^CAMBIA1303连接并转化大肠杆菌DH5α，阳性重组子经PCR鉴定，表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体．用基因抢转化小麦幼胚，经组织培养得到了含有海藻糖合成酶基因的小麦植株． 相似文献
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银杏GbPAL基因启动子表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为弄清GbPAL启动子调控类黄酮代谢的功能,采用双酶切方法,用BamH I+HindⅢ将GbPALp与植物表达载体pBI121分别酶切纯化,通过T4DNA连接酶将GbPALp片段连接到已切除35S启动子的植物表达载体pBI121上,并转化到农杆菌LBA4404上,然后进行菌落PCR及酶切鉴定。结果表明:扩增到的GbPALp片段成功引入了BamH I和HindⅢ酶切位点,GbPALp酶切后与酶切前的条带大小一致;将酶切后的空质粒和引入酶切位点的目的片段进行连接转化后,含目的基因pBI121:GbPALp:LBA4404菌落培养成功。成功构建了GbPAL基因启动子真核表达载体pBI121:GbPALp。 相似文献
17.
[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础. 相似文献
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韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中． 相似文献
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[目的]为更好地研究HSP70热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用PCR方法克隆了水稻花药特异表达启动子Osg6B,将其与设计合成的HSP70反义片段连接,构建了由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HSP70反义表达载体,并进行了PCR和酶切鉴定。[结果]克隆的Osg6B启动子序列与所发表的序列同源性高达97%,启动子区域的顺式调控元件完整;构建的由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HPS70反义表达载体通过了菌落PCR验证和表达载体值粒的酶切鉴定,载体构建成功。[结论]该表达载体的构建将为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。 相似文献