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[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对湖羊睾丸间质细胞(leydig cells, LC)的毒性作用。[方法]用200μmol·L-1 ZEA处理湖羊LC 8 h,通过EdU法检测细胞增殖情况，RT-qPCR和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m6A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LC活性和增殖数量极显著下降(P<0.01);细胞增殖相关基因pcna及其蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01);促凋亡基因表达水平(bax、caspase3,P<0.01;tp53、caspase9,P<0.05)均显著升高，相对应蛋白表达水平(TP53、CASPASE9,P<0.01)极显著升高；抗凋亡基因bcl-2及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);氧化应激相关基因相对表达水平(cat,P<0.05;gsh-px、sod2,P<0.01)显著或极显著上升，其相关蛋白表达水平(SOD2,P<0.01)极显著上... 相似文献
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【目的】克隆湖羊甲基转移酶样蛋白14基因(METTL14)编码区(CDS)序列,探究其分子特征及组织表达分布规律,为揭示METTL14基因调控湖羊肌肉发育的特异性分子机制打下基础。【方法】提取湖羊肌肉组织RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增METTL14基因CDS序列,通过ProtParam、ProtScale、SignaIP-6.0等在线软件进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR进行湖羊METTL14基因组织表达谱分析。【结果】湖羊METTL14基因CDS序列全长1371 bp,共编码456个氨基酸残基;湖羊METTL14基因CDS序列与黄牛、人类、小鼠、大鼠、猕猴、山羊、弯角剑羚、马、双峰驼、野牦牛、野猪和水牛等12个参考物种的METTL14基因核苷酸序列相似性为89.28%～99.78%,对应的METTL14氨基酸序列相似性为98.66%～100.00%;基于METTL14基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,湖羊与山羊的亲缘关系最近,与双峰驼的亲缘关系较远。湖羊METTL14蛋白分子式为C2277H3575N... 相似文献
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甲基化是最为广泛存在的真核生物RNA转录后修饰形式。N6-甲基腺苷(m6A)对真核生物基因转录后调控至关重要,近年来的研究揭示m6A通过招募m6A结合蛋白从而影响包括器官建成、肿瘤形成、节律钟调控及X染色体沉默在内的多种生物学进程。YTH蛋白是目前研究最为深入的m6A结合蛋白,本文从YTH蛋白的分类、识别m6A的分子机理及其生物学功能3个方面详尽阐述了真核生物中存在的多样化的YTH蛋白如何影响具有m6A修饰的RNA的命运,以及如何调控生物体生长发育。最后,讨论了目前YTH蛋白研究仍有待解决的问题,展望了其在药物研发、作物育种等领域中的应用价值。 相似文献
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【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低（与背最长肌相比）。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素（MYOG）和肌球重链蛋白3（MYH3）相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。 相似文献
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【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。 相似文献
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《中国农业科学》2020,(20)
【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链(MyHC)蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期(P0.05)。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著(P0.05)。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05);而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。 相似文献
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牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品,提取其RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞,通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒,以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达,其在成年牛的背脂中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低,且FoxO1在犊牛背最长肌... 相似文献
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【目的】构建骨骼肌特异表达目的基因卵泡抑制素（follistatin,FST）的真核表达载体pCFCDs-red和 pSPFCDs-red,分别转染到不同细胞系中,检测FST及下游基因在RNA和蛋白水平的表达情况,同时测定骨骼肌特异启动子SP和α-actin的启动效率,以研究FST的特异表达对肌肉发育的影响。【方法】利用脂质体分别将真核表达载体pCFCDs-red和pSPFCDs-red转染到绵羊胎儿成纤维细胞（SFFCs）、骨骼肌卫星细胞（SMSCs）和SMSCs诱导肌管中,获得转基因细胞;对获得细胞的生长状况、细胞周期、细胞形态大小以及目的基因和下游基因的表达情况,分别用流式细胞仪、实时定量PCR和western blotting等方法进行检测分析。【结果】①转基因细胞系的生长趋势与非转基因细胞相似,转基因SMSCs细胞增殖的速度高于转基因SFFCs细胞;②流式细胞仪分析表明,转基因细胞系转染后70%以上细胞均处于G0/G1期,保持旺盛的分裂能力、具有单一峰值、细胞的整倍性好、细胞电子体积显著增大;③实时定量PCR及western blotting检测结果表明,转基因细胞系中FST的RNA及蛋白水平相比非转基因细胞系均上调;④转基因SMSCs和肌管相比转基因SFFCs细胞的FST表达量高,转pSPFCDs-red转基因细胞中FST的表达水平比转pCFCDs-red细胞系高。【结论】骨骼肌特异性启动子SP及α-actin能够在SMSCs及肌管中有效启动FST目的基因的表达,且在肌管中具有较高的表达量,SP启动子的启动效率较高于α-actin。在肌源性细胞中,FST的上调可以引起MSTN蛋白水平的下调,FST对骨骼肌细胞的生长发育具有一定促进作用。 相似文献
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【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。 相似文献
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【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度（0、50、100和200 μmol∙L-1）的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链（MyHC）的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示,50和100 μmol∙L-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组（P<0.05）;CCK8测得50和100 μmol∙L-1 Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组（P<0.05）;100和200 μmol∙L-1的Trolox显著上调了PAX7的表达（P<0.05）,对PAX7蛋白的表达有上调趋势,但无显著差异（P>0.05）;添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低（P<0.001）;在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调（P<0.05）,而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化（P>0.05）;免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异（P>0.05）。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。 相似文献
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猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。 相似文献
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【目的】为了探索秦川牛（Bos taurus）SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1（NM_001077107.2）已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列siSMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-bSMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列siSMAD1和过表达腺病毒AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%（诱导1d,P<0.01）、66.7%（诱导3d,P<0.01）、60.0%（诱导6d,P<0.01）、54.7%（诱导9d,P<0.01）。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10 10pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍（诱导1d）、3.19倍（诱导3d）、105.3倍（诱导3d）,P<0.01）和144倍（诱导9d,P<0.01）;结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。 【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列siSMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。 相似文献
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【目的】研究肌肉因子IL-15（interleukin 15）对猪骨骼肌成肌细胞增殖与凋亡的影响,为进一步研究IL-15在动物肌肉品质调控和骨骼肌疾病治疗提供依据。【方法】构建IL-15过表达慢病毒载体GV-492-IL-15,体外无菌分离培养猪骨骼肌卫星细胞,诱导分化,并通过免疫荧光染色进行成肌细胞验证。将成肌细胞转染IL-15过表达重组慢病毒载体,试验分别设置空白对照组（Control）、转染阴性对照病毒组（IL-15-）和转染GV-492-IL-15（IL-15+）慢病毒试验组（n=3）。培养72 h后,收集细胞和培养上清液。分别采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot技术分析目的基因和蛋白的表达情况,采用ELISA试剂盒分析培养液中IL-15含量,采用CCK-8试剂盒分析成肌细胞活力,采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot技术检测与细胞凋亡密切相关的caspase-3蛋白表达水平的变化。【结果】（1）经鉴定后的质粒转染293T细胞,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经Western Blot检测,可以观察到20 kD附近处有特征条带;（2）分离培养的猪骨骼肌卫星细胞呈梭形或纺锤形,诱导后可分化为呈管状的成肌细胞。将分化后的成肌细胞,进行α-SMA单克隆抗体免疫荧光染色,视野中90%的细胞呈阳性反应,胞浆染成红色,表明细胞为骨骼肌成肌细胞。（3）转染GV-492-IL-15慢病毒后,与对照细胞组相比,成肌细胞内IL-15 mRNA和蛋白相对表达量均极显著升高（P<0.001）,但培养液中IL-15蛋白水平变化不大（P>0.05）。CCK-8结果显示,过表达IL-15可增强细胞的增殖能力（P<0.05）。与对照组相比,转染GV-492-IL-15慢病毒的细胞早期凋亡率差异不显著（P>0.05）,但细胞晚期凋亡率显著下降（P<0.05）。与对照组相比,转染慢病毒组细胞中caspase-3蛋白有下降的趋势,但差异不显著（P>0.05）。此外,转染IL-15过表达慢病毒可使G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）。【结论】在正常生理条件下,IL-15是定位在细胞内并发挥作用的,IL-15过表达对猪骨骼肌成肌细胞早期凋亡没有显著影响,但可以抑制其晚期凋亡,并促进细胞增殖。这一研究将为IL-15正向调控猪骨骼肌肌肉品质和治疗相关肌肉疾病提供技术和理论依据。 相似文献
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【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。 相似文献
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【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验,分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响,为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织,采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞;构建包装lncFAM200B超表达腺病毒,设计合成其siRNA干扰序列;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平;采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞;lncFAM200B超表达后,脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05）,随着诱导分化时间的增加,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势,PTEN表达量呈现先增高后降低趋势;细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05）,且胞内形成较大脂滴;超表达4 d后,细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.05）。干扰lncFAM200B可显著降低脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2的表达水平（P<0.05）,降低细胞脂肪沉积,且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P<0.05）;干扰lncFAM200B后其潜在靶基因SIRT1呈现先升高后降低的表达趋势,PTEN则相反。CCK-8增殖实验表明,lncFAM200B超表达72 h后,细胞增殖效率显著降低（P<0.05）,而干扰lncFAM200B后72 h后细胞增殖效率显著增强（P<0.05）。【结论】lncFAM200B可能通过影响脂肪分化标志基因C/EBPα和AP2,脂肪合成相关基因SIRT1和PTEN的表达从而影响牦牛肌内脂肪沉积,但其具体机制还需要进一步研究。 相似文献
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【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3 基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA（NC）,并进行诱导分化培养至第0天和第4 天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α, C/EBPα）,脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α, ACCα）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第 4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2 具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天 和第4 天与对照组相比分别下调了58% 和37%,达到了差异极显著（P<0.01）,C/EBPα 的表达量也分别下调了64% 和41%,达到了差异极显著（P<0.01）。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4 天分别下调了89% 和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50% 和37%, 而FAS的表达量则分别下调了73% 和19%,都分别达到了差异极显著（P<0.01）。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降（P<0.05）。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。 相似文献