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【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。 相似文献
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【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。 相似文献
3.
【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著,在小麦与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源植物激素水杨酸、茉莉酸诱导TaHin1上调表达,脱落酸诱导其下调表达,而乙烯不诱导其表达;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调表达。【结论】首次克隆到一个受条锈菌诱导的小麦TaHin1,可能通过水杨酸、茉莉酸信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,而脱落酸在防御反应中起负调控作用,该基因在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。 相似文献
4.
【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。 相似文献
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条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483 bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列,其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明,TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调,成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因,该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。 相似文献
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小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中编码分泌蛋白的序列预测 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】植物与病原菌互作过程中,涉及许多可以与植物受体蛋白相互识别、引发植物防卫反应的病原菌激发子或其他致病因子,其中多数为分泌蛋白,深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。【方法】通过SignalP v3.0、TMHMM v2.0、TargetP v1.1、Protcomp v6.0 4个软件,对陕西省农业分子生物学重点实验室构建的小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中854条EST序列进行分泌蛋白预测。【结果】得到具有可溶性分泌信号肽的蛋白编码序列33条,占测定序列的3.86%,其中最小长度为196 bp,最大为1 096 bp,分泌信号肽切割位点基本位于15~42个氨基酸,平均为37个氨基酸。【结论】预测得到的分泌蛋白编码序列,可以作为小麦与条锈菌互作过程中的激发子和致病因子备选基因来进一步研究。 相似文献
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【目的】克隆小麦条锈菌产孢相关基因PsCon1,分析其在病菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PsCon1的cDNA序列和基因组序列,采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域等基本特性,运用实时荧光定量RT-PCR技术分析PsCon1在夏孢子,芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PsCon1由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长为252bp,编码83个氨基酸;编码的蛋白PSCON1不含跨膜区,无信号肽,定位在细胞质,具有2个conidiation-specific protein6保守结构域。PsCon1与小麦秆锈菌核苷酸序列的一致性在外显子区为78%,内含子区为43%,与小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的亲缘关系最近,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和费氏新萨托(Neosartorya fischeri)的亲缘关系次之。PsCon1在小麦条锈菌萌发夏孢子时期基因表达量为新鲜夏孢子中的1.69倍。在亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后6h和24h表达量最高,分别为在新鲜夏孢子中表达量的3.21倍和2.91倍;在接种后24h至168h,基因表达基本呈下调趋势,在接种后168h的表达量最低,仅为夏孢子时期的0.0004倍,在接种后216h和264h,表达量有所增加,表达量约为接种后168h的15倍。在非亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后36h表达量最高,但仅为新鲜夏孢子基因表达量的0.13倍,基因表达总体呈下调趋势。【结论】PsCon1参与了小麦条锈菌对小麦的侵染,可能作为一个致病相关基因影响了条锈菌芽管和吸器的形成,同时促进了条锈菌在侵染过程中的产孢。PsCon1的克隆为进一步研究该基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能奠定了基础。 相似文献
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小麦与条锈菌亲和互作的差减文库构建及初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST（unigene）。经Blast X比对和功能分类分析,其中50条unigene（33.6%）未找到同源性匹配,25条（16.8%）与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌有较高同源性的基因。随后,进一步利用RT-PCR对6个基因的表达模式进行了分析。【结论】成功构建了小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离出一部分与小麦条锈病发病相关的基因,可用于进一步研究条锈菌侵染过程中特异基因的功能。 相似文献
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明确条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)效应蛋白基因PSTG_23616的时空表达特征,旨在解析该基因在病菌生长发育及致病过程中的作用。利用RT-PCR和PCR克隆获得PSTG-23616的cDNA和基因组DNA全长;借助生物信息学软件分析PSTG-23616蛋白序列特征并构建系统进化树;通过酵母分泌系统、农杆菌介导的瞬时表达系统、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)、亚细胞定位技术初步明确该基因的功能。结果表明,PSTG_23616基因组全长937bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长699bp。生物信息学软件预测结果显示,PSTG-23616信号肽为位于N端的1~22个氨基酸;酵母分泌系统分析表明,PSTG-23616的信号肽具有分泌功能,为典型的分泌蛋白;注射含有PSTG_23616的重组农杆菌菌液,可抑制由BAX引起的细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)反应;qRT-PCR结果表明,PSTG_23616在小麦条锈菌初侵染过程中一直上调表达,24h表达量达到顶峰;亚细胞定位分析表明,PSTG_23616在整个细胞均有分布。推测,该效应蛋白参与条锈菌侵染结构的分化,同时在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。 相似文献
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【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO2浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶（β- carbonic anhydrase,βCA）是植物CO2感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄（Solanum lycopersicum）等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network 数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型（wild-type,WT）番茄‘Ailsa Craig’（AC）为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）,利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株（OE-SlβCA3）。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2 100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工（糖基化）,氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。 相似文献
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【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14... 相似文献
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【背景】近年来,我国番茄生产中面临的不良气候环境导致露地和设施栽培中番茄病害日益严重。由丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）所引发的番茄细菌性叶斑病频发,严重影响了番茄的产量、品质。糖是植物体内重要的信号分子与营养物质,在植物遭受病原菌侵染时,糖既可以作为信号参与调控植物抗病性,也可以作为主要碳源为免疫反应提供能量。STP（sugar transport protein）家族是一类糖转运蛋白家族,在植物生长发育过程与病原防御中起着重要作用。【目的】明确番茄中STP家族是否参与调控植株对细菌性叶斑病的抗性。【方法】以番茄CR品种（Solanum lycopersicum cv. Condine Red）为材料,通过接种Pst DC3000,明确STP基因家族对Pst DC3000的响应。构建SlSTP2的突变材料与过表达材料,并进行鉴定、繁种。在野生型和SlSTP2基因突变体、过表达植株上接种Pst DC3000,观察比较叶片发病情况、台盼蓝染色显示的死细胞数量,检测叶片菌落数（colony-forming units,CFU）和光系统II实际光化学效率,明确SlSTP2在植株防御细菌性叶斑病中的作用。为探究SlSTP2防御Pst DC3000的内在分子机制,通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary,BiFC）试验筛选互作蛋白,构建编码该蛋白的基因突变与过表达材料,并接种Pst DC3000明确其在植株防御细菌性叶斑病中的作用。【结果】在番茄植株上接种Pst DC3000后,SlSTP1和SlSTP2表达上调,选取上调最显著的SlSTP2作为后续研究对象,构建其突变材料与过表达材料。在番茄野生型和Slstp2突变植株、OE:SlSTP2过表达植株上接种Pst DC3000,相比野生型植株,Slstp2植株细菌性叶斑病的发病情况更严重,叶片CFU与台盼蓝染色显示出的死细胞数均更多,光系统II实际光化学效率下降,OE:SlSTP2植株则相反。通过BiFC试验发现,SlSTP2与G蛋白β亚基SlAGB1互作。接种Pst DC3000后,Slagb1突变体发病较野生型重,呈现与Slstp2突变体一致的发病表型;OE:SlAGB1则与OE:SlSTP2植株同样表现出更强的抗性。【结论】SlSTP2受Pst DC3000诱导,并正调控番茄对细菌性叶斑病的抗性,且SlSTP2与正调控因子SlAGB1互作,推测SlSTP2调控番茄细菌性叶斑病抗性与SlAGB1有关。 相似文献
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【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。 相似文献
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【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L-1 KT、0.5 mg·L-1 6-BA和0.05 mg·L-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L-1 CuSO4显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T0代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。 相似文献
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【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。 相似文献
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【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟（Nicotiana benthamiana）对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）,观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00％、98.33％,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67％,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00％、86.67％,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。 相似文献
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【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。 相似文献
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【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。 相似文献